抗菌肽LL37聯合肽聚糖對單核細胞分化的影響

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3高春巖1申宇鴻1

抗菌肽LL37聯合肽聚糖對單核細胞分化的影響

錢 青1白彥萍2錢 雷3李 明

3高春巖1申宇鴻1

目的： 明確LL37聯合肽聚糖（PGN）對單核細胞分化的影響。方法： 健康成年人外周血單核細胞經LL37、PGN、LL37+PGN刺激培養，16 h后流式細胞術（FCM）檢測細胞表面CD14、CD16、髓系細胞觸發受體-1（TREM-1），5天后檢測不成熟樹突狀細胞（iDC）表面標記HLA-DR、CD1a、CD86的表達。誘導形成的iDC與異體淋巴細胞共培養3天，FCM檢測Th17細胞的表達，MTT法檢測T細胞的增殖。結果： LL37+PGN組與PGN組、LL37組比較，CD14++CD16+單核細胞亞群比例、細胞表面TREM-1表達、iDC比例、T細胞增殖和Th17細胞比例均明顯增加，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。結論： LL37聯合PGN誘導單核細胞向CD14++CD16+單核細胞亞群極化，最終導致T細胞增殖和向Th17細胞分化。

銀屑病； 抗菌肽LL37； 肽聚糖； 單核細胞

銀屑病是一種常見的慢性炎癥性皮膚病，是具有特定遺傳背景（基因）的人群在環境（以感染為主）的作用下引起復雜的細胞免疫紊亂。除了自身反應性T細胞活化和表皮角質形成細胞異常增殖，固有免疫系統因細菌、真菌等微生物感染引起過度活化在疾病過程中也發揮重要作用。1其中，單核巨噬細胞活化，在病損部位產生炎癥因子、趨化因子，導致炎癥反應，并影響適應性免疫，誘導Th17形成，參與疾病的發生發展。2

抗菌肽LL37和細菌細胞壁主要成分肽聚糖（peptidoglycan，PGN）在銀屑病發病機制中均發揮重要作用。3患者皮損中含有PGN的巨噬細胞比例升高，并導致T細胞增殖；4PGN還可誘導角質形成細胞（KC）分泌高濃度的LL37，導致皮損處和血液中LL37升高。5另一方面，LL37可作為免疫效應活化分子，減輕病原微生物對單核巨噬細胞的刺激。6因此，有必要探討LL37聯合PGN對單核細胞生物學功能的影響，闡明單核細胞在銀屑病疾病過程中的作用。

1　材料與方法

1.1研究對象 選取健康志愿者10名，男、女各5名，年齡22.4±5.1歲，無自身免疫性疾病或近期感染史，經北京市和平里醫院倫理委員會批準，征得志愿者知情同意并簽訂知情同意書，采集外周血。

1.2主要儀器與試劑 LL37購自Innovagen公司，PGN購自Invivogen公司，異硫氰酸熒光素（FITC）鼠抗人-CD14、葉綠素蛋白偶聯物（PerCP-cy5.5）鼠抗人-CD16、PE-鼠抗人CD1a、PE-鼠抗人CD86、別藻藍蛋白（APC）鼠抗人-HLA-DR單克隆抗體及同型對照購自BD公司，PE-鼠抗人髓系細胞觸發受體-1（TREM-1）及同型對照購自R&D公司；RPMI 1640細胞培養液購自Gibco公司；重組人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（rhGM-CSF）、重組人白介素-4（rhlL -4）購自Peprotech公司；人淋巴細胞分離液（Ficoll）購自上海恒信；白細胞介素-6（IL-6）、IL-8、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-1β、IL-23、粒細胞巨噬細胞刺激因子（GM-CSF）檢測試劑購自Bio-Rad公司，用Luminex200流式熒光檢測儀分析。Th1/Th17流式檢測試劑盒購自BD公司。四氮唑鹽（MTT）購自Sigma公司。流式細胞儀FACSCanto為BD公司產品。

1.3方法

1.3.1貼壁法分離健康志愿者單核細胞 健康成人靜脈血經肝素抗凝，用Ficoll密度梯度離心法分離單個核細胞（PBMC），用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次，1500 rpm離心6 min，棄上清，RPMI 1640細胞培養液（10%胎牛血清、100 U/L青霉素、100 U/L鏈霉素）重懸，置于37℃5%CO2孵箱培養2 h后傾去未貼壁細胞，再加入RPMI 1640細胞培養液，繼續培養6 h，收集單核細胞，經FITC-鼠抗人CD14鑒定細胞純度85%～90%，臺盼藍拒染法鑒定細胞存活率＞95%。

1.3.2LL37和PGN刺激單核細胞 將濃度為1× 105/mL的單核細胞接種在96孔或24孔培養板內，分別加入10μg/mL PGN、20μg/m L LL37、LL37（20 μg/mL）+PGN（10μg/mL），置于37℃ 5%CO2孵箱培養16 h后，收集部分培養孔，1500 rpm離心6 min，吸取上清液作細胞因子檢測，收集細胞，PBS洗滌，分別用于流式細胞術（FCM）檢測CD16、CD14、TREM-1平均熒光強度（MFI）或陽性細胞頻率。其余細胞置于37℃ 5%CO2孵箱誘導形成不成熟樹突狀細胞（iDC），用rhGM-CSF（50 ng/m L）+rhlL-4（25 ng/m L）培養部分細胞作為對照組，培養至5天，收集細胞，PBS洗滌后，部分細胞用于 FCM檢測CD14、HLADR、CD1a、CD86陽性細胞頻率，部分細胞用于同種異體混合淋巴細胞反應（MLR）。

1.3.3流式細胞術檢測細胞表面受體 每100μL細胞培養液加入10μL各種流式抗體及同型對照，室溫避光孵育30min，用1m L PBS洗滌2次，1500 rpm離心6 min，棄上清，加入400μL PBS重懸細胞。用FACSCanto檢測，并采用BD FACSDiva軟件分析數據。以所有細胞設門，讀取細胞CD14、CD16、CD1a、HLA-DR、CD86、TREM-1平均熒光強度（MFI）或陽性細胞頻率。

1.3.4混合淋巴細胞反應 取異體健康成人肝素抗凝外周血，用Ficoll密度梯度離心法分離PBMC，PBS洗滌，于37℃貼壁培養4 h后收集非貼壁細胞作為同種異體T細胞備用。將上述培養的iDC用RPMI 1640完全培養液調整細胞濃度為1×105/mL，將iDC與T細胞按1∶10的比例接種于96孔板，終體積200 μL/孔，置于37℃ 5%CO2孵箱培養3 d，部分細胞采用MTT比色法檢測T細胞增殖，其余細胞用FCM檢測Th17細胞頻率。

1.3.5MTT比色法檢測 T細胞增殖 終體積200 μL/孔，加入100μLMTT（5 g/L）繼續孵育4 h，離心棄上清后，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150μL，孵育10 min，酶標儀檢測A570值，結果以3復孔均值表示。

1.3.6Luminex200檢測上清液細胞因子濃度 所有上清液收集后，立即儲存在-80℃。按試劑說明書檢測上清液IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-23、GMCSF，用Luminex200流式熒光檢測儀分析。

1.4統計學方法 用Stata7.0統計軟件對數據進行正態性檢驗，本次研究全部為計量資料，均為正態性分布，用均數±標準差表示，多組比較用單因素方差分析（ANOVA），作雙側檢驗，P＜0.05為有統計學意義。

2　結果

2.1LL37聯合PGN對單核細胞分泌細胞因子的影響 LL37、PGN、LL37+PGN與單核細胞孵育16 h，檢測上清液細胞因子濃度。與空白對照組相比，LL37組IL-6、TNF-α、IL-8降低，但IL-1β升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；PGN組IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-23升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。LL37+PGN組與PGN組比較，IL-6、TNF-α、IL-8降低，GM-CSF、IL-1β升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。結果見表1。

2.2LL37聯合PGN對單核細胞極化和TREM-1表達的影響 LL37、PGN、LL37+PGN與單核細胞孵育16 h，LL37組、PGN組與空白對照組比較，CD14++CD16+單核細胞亞群比例差異無統計學意義（P＞0.05）；LL37+PGN組與其它3組比較，CD14++CD16+單核細胞比例升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與空白對照組、LL37組比較，PGN組、LL37+PGN組TREM-1MFI均升高，但LL37+PGN組升高更顯著，差異有統計學意義（P＜0.05）。結果見表2。TREM-1MFI和CD14++CD16+陽性細胞頻率（R4區）分別見圖1和圖2。

2.3LL37聯合 PGN誘導單核細胞向iDC分化

LL37、PGN、LL37+PGN與單核細胞孵育5 d，FCM檢測細胞表面CD1a、HLA-DR、CD14陽性細胞頻率。LL37組、PGN組與空白對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05），LL37+PGN組CD1a、HLA-DR、CD86陽性細胞頻率增高，CD14陽性細胞頻率降低，與其它3組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。但誘導iDC形成的比例低于rhGM-CSF+rhlL-4誘導形成的iDC，差異有統計學意義（P＜0.05），結果見表3。

2.4iDC誘導T細胞增殖和Th17細胞分化 iDC與異體淋巴細胞共培養3 d，LL37+PGN組T細胞增殖顯著升高，與其它3組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。LL37+PGN組和PGN組均可誘導T細胞向Th17分化，但LL37+PGN組誘導的Th17細胞比例高于PGN組，差異有統計學意義（P＜0.05），結果見表4，Th17細胞流式檢測圖，見圖3。

表1　單核細胞培養上清液細胞因子濃度

表2　中間型單核細胞比例和TREM-1表達

表3　單核細胞分化為iDC頻率

表4　Th17細胞比例和T細胞增殖

圖1　單核細胞TREM-1MFI

圖2　單核細胞亞群檢測

圖3　Th17細胞陽性頻率流式圖

3　討論

較多研究者認為PGN是誘發銀屑病的重要因素，4此理論有下列依據：（1）銀屑病患者存在肽聚糖識別蛋白家族3（PGRP3）和PGRP4基因突變；（2）在銀屑病患者病變皮膚處可分離出識別細菌PGN的抗原特異性T細胞；（3）通過16S rRNA基因序列分析、革蘭氏染色、免疫熒光等多種技術證實，在正常人皮膚的表皮、真皮和淺表脂肪組織都存在細菌及其產物，從而導致各種免疫細胞可與細菌相互接觸。最常見的細菌包括葡萄球菌和鏈球菌等，另外，機體其他部位的感染，如：扁桃體、腸道、牙周炎也會誘發銀屑病。

抗菌肽LL37在正常皮膚不表達，而在銀屑病皮損中高表達，主要來源于皮膚角質形成細胞（KC），部分來源于趨化到局部的中性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞等免疫細胞。KC高表達LL37的誘因是創傷、感染和藥物。LL37可防御機體免受微生物侵襲，但LL37通過多個機制參與銀屑病的發病，如：LL37/ DNA、LL37/RNA復合物，分別以Toll樣受體（TLR）9、TLR7依賴的方式激活漿細胞樣樹突細胞（pDC），還可以刺激KC分泌IFN-α、IL-1β、IL-6，激活髓樣樹突狀細胞（mDCs），LL37/RNA復合物也可直接通過TLR-8依賴的方式激活mDCs。3

本次研究發現，LL37能減少PGN引起的單核細胞分泌TNF-α、IL-6、IL-8等炎癥分子，但促進分泌IL-1β、GM-CSF。LL37及其片段衍生的陽離子肽具有調節細胞因子分泌的功能，Ruan等6研究發現，LL37可通過抑制TLR2配體脂磷壁酸（LTA）活化p38MAPK和 Akt磷酸化，從而抑制巨噬細胞分泌TNF-α、IL-6等炎癥分子，減少促炎細胞因子的釋放。LL37的片段LL33可促進單核細胞分泌IL-1β。7

LL37可明顯上調PGN對單核細胞TREM-1的活化，Amatngalim的研究也有類似的結果，8機制可能是LL37能影響了細胞膜的動力學，有助于PGN進入細胞內。9TREM-1活化可導致單核細胞產生IL-1β、GM-CSF、IL-8、髓過氧化物酶（MPO）、IL-6、TNF-α等促炎細胞因子，從而放大炎癥反應。10TREM-1活化還可誘導巨噬細胞向促炎型（M1）極化，抑制GMCSF活性可阻斷此極化作用。11本次實驗單核細胞經LL37聯合PGN刺激培養16 h，觀察到單核細胞向中間型（CD14++CD16+）極化，中間型單核細胞具有較強的抗原提呈和加工能力；經典型（CD14++CD16-）單核細胞具有很強的吞噬功能；非經典型（CD14+CD16++）單核細胞主要在血管內壁執行巡邏任務，在浸潤組織后分化為巨噬細胞。12

單核細胞經LL37聯合PGN刺激培養5 d，觀察到iDC特征性標記CD1a及其MHCII分子HLA-DR表達增加，單核細胞特征性標記CD14表達顯著下降，提示細胞在LL37聯合PGN的刺激下逐漸向iDC分化。LL37和TREM-1在單核細胞分化為DC的過程中均可發揮調控作用。Bleharski等10用TREM-1活化性抗體活化單核細胞TREM-1，誘導單核細胞分化為iDC，高表達CD1a、CD86、和MHC II類分子，導致T細胞增殖。在缺氧微環境下，TREM-1在誘導單核細胞分化為DC的過程中發揮重要作用。13單核細胞在LL37存在的條件下，GM-CSF/IL-4誘導的iDC表面CD86、CD11b、CD11c和CD18表達增加。14

在機體免疫應答反應中，Th屬于適應性免疫系統，DC等抗原提呈細胞接受刺激的抗原性質和微環境決定初始CD4 T細胞向Thl、Th2、Thl7等不同亞群分化。目前銀屑病被界定為Thl/Thl7共同介導的免疫紊亂。Th1分泌干擾素1（IFN-γ）、IL-2和TNF-α等，Thl7則分泌IL-17和IL-22等細胞因子，這些細胞因子單獨或者協同作用，引起銀屑病的病理改變，拮抗Th1/Th17細胞因子的生物制劑對銀屑病具有肯定的臨床療效。本次實驗LL37和PGN誘導單核細胞形成的iDC與異體淋巴細胞共培養，誘導T細胞增殖和向Thl7分化。已證實，與正常皮膚相比，銀屑病患者病損組織單核細胞來源的DC明顯增多，15高表達MHC II類分子，并分泌IL-12和IL-23誘導Th細胞分化為Thl和Thl7。Hyder等16研究也表明，與健康人皮膚組織相比，銀屑病患者皮損組織TREM-1陽性細胞約升高了3倍，經雙色熒光染色檢測，TREM-1陽性細胞主要包括：髓系樹突狀細胞（mDC）、內皮細胞、巨噬細胞。

綜上所述，在LL37和PGN同時存在的情況下，單核細胞減少了TNF-α、IL-6、IL-8等炎癥因子的產生，但GM-CSF分泌增加，活化TREM-1，誘導單核細胞向中間型單核細胞極化，并進一步分化為iDC細胞，然后影響適應性免疫，導致Th17細胞分化增加。此機制可能在銀屑病發生發展中具有重要作用。但是，本次研究是體外實驗，與體內的免疫反應可能有較大差異。因此，通過阻斷單核細胞向中間型單核細胞極化和iDC分化來治療銀屑病尚需進一步深入研究。

1王剛.銀屑病研究熱點.中華皮膚科雜志，2013，46（3）：153-156.

2Evans HG，Gullick NJ，Kelly S，et al.In vivo activated monocytes from the site of inflammation in humans specifically promote Th17 responses.Proc Natl Acad Sci USA，2009，106：6232 -6237.

3 Batycka-Baran A，Maj J，Wolf R，et al.The new insight into the role of antimicrobial proteins-alarmins in the immunopathogenesis of psoriasis.J Immunol Res，2014，2014：628289.

4 Fry L，Baker BS，Powles AV，et al.Is chronic plaque psoriasis triggered by m icrobiota in the skin？Br J Dermatol，2013，169（1）：47-52.

5 Hwang YJ，Jung HJ，Kim MJ，et al.Serum levels of LL-37 and inflammatory cytokines in plaque and guttate psoriasis.Mediators Inflamm，2014，2014：268257-268267.

6Ruan Y，Shen T，Sun T，etal.Antimicrobial peptide LL-37 attenuates LTA induced inflammatory effect in macrophages.Int Immunopharmacol，2013，15（3）：575-580.

7Gustafsson A，Sigel S，Ljunggren L.The antimicrobial peptide LL37 and its truncated derivatives potentiates proinflammatory cytokine induction by lipoteichoic acid in whole blood.Scand J Clin Lab Invest，2010，70（7）：512-518.

8 Amatngalim GD，Nijnik A，Hiemstra PS，et al.Cathelicidin peptide LL-37 modulates TREM-1 expression and inflammatory responses tomicrobial compounds.Inflammation，2011，34（5）：412-425.

9Sandgren SA，Wittrup F，ChengM，etal.The human antimicrobial peptide LL-37 transfers extracellular DNA plasmid to the nuclear compartment ofmammalian cells via lipid rafts and proteoglycan-dependent endocytosis.JBiological Chem istry，2004，279：17951-17956.

10 Bleharski JR，Kiessler V，Buonsanti C，et al.A role for triggering receptor expressed onmyeloid cells-1in host defense during the early induced and adaptive phases of the immune response.J lmmunol，2003，170（7）：3812-3818.

11 Lo TH，Tseng KY，TsaoWS，etal.TREM-1 regulatesmacrophage polarization in ureteral obstruction.Kidney Int，2014，86（6）：1174-1186.

12Wong KL，Yeap WH，Tai JJ，etal.The three humanmonocyte subsets：implications for health and disease.Immunol Res，2012，53（1-3）：41-57.

13 Bosco MC，Pierobon D，Blengio F，et al.Hypoxiamodulates the gene expression profile of immunoregulatory receptors in humanmature dendritic cells：identification of TREM-1 as a novel hypoxic marker in vitro and in vivo.Blood，2011，117（9）：2625-2639.

14Davidson DJ，Currie AJ，Reid GS，et al.The cationic antimicrobial peptide LL-37 modulates dendritic cell differentiation and dendritic cell-induced T cell polarization.J Immunol，2004，172（2）：1146-1156.

15 Lima Ede A，Lima Mde A.Reviewing concepts in the immunopathogenesisof psoriasis.An Bras Dermatol，2011，86（6）：1151 -1158.

16 Hyder LA，Gonzalez J，Harden JL，etal.TREM-1 as a potential therapeutic target in psoriasis.J Invest Dermatol，2013，133（7）：1742-1751.

（收稿：2015-01-29 修回：2015-05-14）

·臨床研究·

Effect of antim icrobial peptides LL37 com bined w ith peptidoglycan on the d ifferentiation ofmonocytes

QIAN Qing，BAIYan-ping，QIAN Lei，et al.Department ofDermatology，Peking Hepingli Hospital，Beijing，P.R.China，100013

Objective：To determine the effectof antimicrobial peptides LL37 combined with peptidoglycan（PGN）on the differentiation ofmonocytes.Methods：Monocytes from peripheral blood of healthy adultswere cultured in themedium of LL37，PGN and LL37 combined PGN.The levels of triggering receptor expressed on myeloid cells-1（TREM-1），CD14 and CD16 were detected by flow cytometry（FCM）after 16 h culture.The levels of HLA-DR，CD1a and CD86 on immature dendritic cell（iDC）were detected by FCM after culture for 5 days.T cells proliferation and Th17 polarization were detected by MTT and FCM respectively after iDC cocultured with lymphocyte for 3 days.Results：The percentage of CD14++CD16+monocytes and Th17，the levels of TREM-1 and iDC and the proliferation of T cells in the LL37 combined PGN group were obviously higher than those in the PGN group and LL37 group（P＜0.05）.Conclusion：Antimicrobial peptides LL37 in combination with PGN can induce themonocytes differentiation into CD14++CD16+，which finally induce the proliferation of T cells and differentiation to Th17.

psoriasis；antimicrobial peptides LL37；peptidoglycan；monocytes

北京市東城區科技計劃項目（編號：2014-4-005）

1北京市和平里醫院，北京，100013

2北京市中日友好醫院，北京，100013

3鹽城市濱海縣人民醫院，江蘇濱海，224500