Dermol與E—cadherin在喉鱗狀細胞癌組織中的表達及其相關性研究

楊文婧　趙瑞力

[摘要] 目的 探討喉鱗狀細胞癌組織中Dermol與E-cadherin的表達及其相關性。 方法 應用免疫組化SP法檢測Dermol與E-cadherin在48例喉鱗癌組織及30例癌旁正常組織中的表達情況，分析它們在不同組織中的相互關系及與喉鱗癌臨床參數的關系。 結果 Dermol、E-cadherin在喉鱗癌及癌旁正常組織中的陽性表達率比較，差異均有高度統計學意義（P < 0.01）；不同淋巴結轉移及臨床分期情況的喉鱗狀細胞癌組織中Dermol、E-cadherin的陽性表達率比較，差異均有統計學意義（P < 0.01或P < 0.05）；不同年齡的喉鱗狀細胞癌組織中Dermol、E-cadherin的陽性表達率比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。喉鱗狀細胞Dermol的陽性表達與E-cadherin的陽性表達呈負相關（r = -0.344，P < 0.05）。 結論 Dermol與E-cadherin在喉鱗狀細胞癌發生、分化程度、浸潤及轉移過程中的起重要作用，Dermol與E-cadherin的協同作用可能影響喉鱗狀細胞癌的浸潤和轉移。

[關鍵詞] 喉鱗狀細胞癌；Dermol；E-cadherin；免疫組化

[中圖分類號] R739.65 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）09（c）-0125-04

[Abstract] Objective To investigate the expression and clinical significances of Dermol and E-cadherin in laryngeal squamous cell carcinoma （LSCC）. Methods The expression of Dermol and E-cadherin was detected by immunohistochemistry SP method in 48 tissues of LSCC and 30 tissues of tumor-adjacent normal. The relationship between two factors and clinical pathological features of LSCC was investigated. Results The differences of the positive rate of Dermol and E-cadherin in tissues of LSCC and tumor-adjacent normal were statistically significant （P < 0.01）； the positive expression rate of Dermol and E-cadherin in different status of lympha node metastasis， clinical stage in LSCC was statistical significant different （P < 0.01 or P < 0.05）； but no statistically significant difference between the different age groups （P > 0.05）. The positive expression of Dermol was negatively related to that of E-cadherin （r = -0.344， P < 0.05）. Conclusion Dermol and E-cadherin play an important role in the occurrence， degree of differentiation， infiltration and metastasis of laryngeal squamous cell carcinoma. The synergistic effect of Dermol and E-cadherin may have some effects on the infiltration and metastasis of laryngeal carcinoma.

[Key words] Laryngeal squamous cell carcinoma； Dermol； E-cadherin； Immunohistochemistry

喉癌是頭頸部腫瘤中最為常見的一種，其中又以喉鱗狀細胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC）最為多見，喉鱗狀細胞癌具有較高的侵襲能力，發生局部復發和轉移的能力較高[1]。雖然喉癌在早期有很高的生存率，但是大多數患者確診時已到了晚期（Ⅲ-Ⅳ期），從而導致了不良的預后效果。盡管手術技術和放療技術得到明顯改善，但喉鱗狀細胞癌的療效仍不十分理想。探索與喉鱗狀細胞癌發生、轉移相關的腫瘤因子，對喉鱗狀細胞癌的的治療有著重要的臨床指導意義。Dermol也被稱為Twist2，屬于堿性Helix-loop-helix（b-HLH）蛋白家族的成員。目前的研究發現Dermol蛋白在不同的腫瘤中表達并不相同，它在發育和腫瘤發展過程中的作用及機制尚不十分清楚，有待進一步研究。為了進一步探討Dermol與E-cadherin在喉鱗狀細胞癌發生、發展及侵襲過程中的作用及兩者的相關性，本研究采用免疫組化法檢測喉鱗狀細胞癌組織及癌旁正常組織中Dermol與E-cadherin的表達情況并進行相關性分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2010年2月～2013年3月滄州市人民醫院（以下簡稱“我院”）耳鼻喉科的喉鱗狀細胞癌手術切除標本及其癌旁正常組織，其中48例喉鱗狀細胞癌組織及癌旁正常組織30例。癌旁組織均經病理檢查明確為正常組織。所有喉癌患者術前都未行放、化療，臨床資料完整。年齡41～80歲，中位年齡60.2歲；高分化13例，中分化19例，低分化16例；Ⅰ、Ⅱ期（早期）18例，Ⅲ、Ⅳ期（晚期）30例；聲門上型17例，聲門型31例。本研究已經我院醫學倫理委員會批準通過。

1.2 實驗方法

1.2.1 主要試劑 Dermol鼠單克隆抗體（Twist2C1a）：sc-81417 Santa Cruz Biotechnology，Inc）；E-cadherin鼠單克隆抗體（ZM-0094北京中衫金橋生物技術有限公司）；鼠二抗免疫組化試劑盒（SP-9002北京中衫金橋生物技術有限公司）；DAB顯色液（ZLI-9032北京中杉金橋生物技術有限公司）。

1.2.2 免疫組織化學S-P方法 所選標本均制成石蠟標本，4 μm連續切片，一抗所選濃度Dermol鼠單克隆抗體1∶100，E-catenin鼠抗人單克隆抗體為1∶50。采用免疫組化SP法，嚴格遵守操作步驟進行實驗。設置PBS代替一抗為陰性對照，為質量控制標準，喉癌旁正常組織為正常對照組。

1.3 結果判定

Dermol蛋白陽性著色位于細胞質，出現片狀或顆粒狀的棕褐色的胞質或胞核細胞為陽性細胞。結果采用半定量記分法判定[2]，首先按陽性著色程度評分，再按陽性細胞所占比例評分，將兩者的乘積作為判定結果：4～12分為陽性，<4分為陰性，陽性表達為異質表達。E-catenin染色定位于細胞膜，采用Mattern積分法[3]，將陽性細胞百分率評分和染色強度評分相乘：陽性指數>3為陽性，≤3為陰性。>10%細胞出現胞質和/或核表達為異位表達，異位表達均陰性。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0統計學軟件進行數據分析，不符合正態分布的改用中位數；計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗；相關性分析用Spearman等級相關分析，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Dermol、E-cadherin在喉鱗癌及癌旁正常組織中的表達

Dermol在喉鱗狀細胞癌中的陽性表達率為58.33%（28/48）高于癌旁正常組織黏膜的16.67%（5/30）；E-cadherin在喉鱗狀細胞癌中的陽性表達率為22.91%（11/48），低于癌旁正常組織黏膜的100.00%（30/30）（P < 0.01）。見圖1、2，表1。

2.2 喉鱗狀細胞癌中Dermol、E-cadherin表達與喉鱗癌臨床病理參數的關系

Dermol在有淋巴結轉移的喉鱗癌組織中的陽性表達率明顯高于無淋巴結轉移者；E-cadherin在有淋巴結轉移的喉鱗癌組織中的陽性表達率明顯低于無淋巴結轉移者，差異均有高度統計學意義（P < 0.01）。Dermol在Ⅰ、Ⅱ期（早期）喉鱗癌組織中的陽性表達率明顯低于Ⅲ、Ⅳ期（晚期）者；E-cadherin在Ⅰ、Ⅱ期（早期）喉鱗癌組織中的陽性表達率明顯高于Ⅲ、Ⅳ期（晚期）者，差異均有統計學意義（P < 0.01或P < 0.05）。Dermol在不同病理分化程度的喉鱗癌組織中陽性表達率比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。E-cadherin在高分化鱗狀細胞癌中的陽性表達率較高，而在中低分化鱗狀細胞癌中未見表達，兩者比較差異有統計學意義 （P < 0.05）。Dermol與E-cadherin在聲門上型喉癌中的陽性表達率與在聲門型喉癌比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。不同年齡喉鱗癌患者喉鱗癌組織中Dermol與E-cadherin陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。見表2。

2.3 Dermol與E-cadherin在喉鱗癌中的相關性

在48例喉癌中，3例癌組織中Dermol、E-cadherin均呈陽性表達，12例癌組織中Dermol、E-cadherin均呈陰性表達。Dermol表達陽性但E-cadherin表達陰性的喉癌組織有25例；E-cadherin表達陽性但Dermol表達陰性的喉癌有8例。經Spearman等級相關分析，兩者表達呈負相關（r = -0.344，P < 0.05）。

3 討論

Dermol是一個高度保守的轉錄因子，屬于螺旋-環-螺旋（bHLH）轉錄因子家族，在不同的種屬之間其核苷酸和氨基酸序列高度保守。Dermol是在使用E12作為引物的一種雙酵母雜交體中首次被發現，由于它的表達模式是在老鼠胚胎的dermis（真皮）組織中，所以被稱為Dermol[4]。后來由于Dermol與Twist1的高度同源和表達模式的重疊性被命名為Twist2。目前大量的研究已經證實，Twist1可以誘導EMT的發生。Dermol可能與Twist1相似誘導EMT的發生。最近研究發現Dermol異常表達與腫瘤有著密切關系，Dermol與乳腺癌、結腸癌、胃癌、甲狀腺癌及肝癌的表達在國內外有相關報道[5-12]，但其在喉鱗狀細胞癌中的表達及其意義卻鮮有報道。

本研究結果表明：Dermol蛋白表達位于細胞質中，呈棕褐色。48例喉鱗癌組織中陽性表達率（58.33%）明顯高于30例癌旁正常組織中陽性表達率（16.67%）（P < 0.01）。在喉鱗癌組織中Dermol蛋白表達與淋巴結轉移、臨床分期相關（P < 0.05或P < 0.01），而與腫瘤病理學分級、臨床分型及年齡無關（P > 0.05）。由此可見，Dermol在喉鱗狀細胞癌中高表達，且在淋巴結轉移與臨床分期具有統計學意義，由此推斷Dermol高表達的鱗狀細胞癌組織具有更強的侵襲能力，Dermol可能成為判斷喉鱗狀細胞癌預防或預后的檢測指標之一。目前研究發現，在口腔/咽部癌癥患者中，Dermol與較高的腫瘤分級和較短的生存率有關，Dermol通過上皮間充質轉化、抑制細胞凋亡來助于頭頸部鱗狀細胞癌的侵襲[13]。

E-catenin是Wnt信號傳導通路中重要的調控一員[14]，當腫瘤細胞中E-catenin遇到啟動子區域甲基化、轉錄抑制或基因突變時，其結構功能便會出現異常，細胞的黏附功能出現障礙，導致了腫瘤細胞的侵襲性生長及遠處轉移[15]。在甲狀腺癌[16]、食道癌[17]、胃癌[18]及喉癌[19]中均發現E-catenin表達下調，并與腫瘤的轉移及復發有一定相關性。國外曾有研究發現[20]，E-catenin在頭頸部鱗癌中表達下調，并與頭頸部鱗狀細胞癌的血管侵襲性和患者生存率相關。本研究發現，癌旁正常組織中E-catenin表達陽性染色定位于細胞膜，而喉鱗狀細胞癌組織中E-catenin表達主要位于細胞質及細胞核中。喉鱗狀細胞癌中E-catenin陽性表達明顯低于癌旁正常組織，喉鱗狀細胞癌的轉移、侵襲能力越高，E-catenin的陽性表達率越低，也同樣證實了E-catenin與喉鱗狀細胞癌的侵襲與轉移相關。

喉鱗狀細胞癌的發生、侵襲及轉移機制相當復雜。通過對EMT機制研究發現，Dermol形成Twist1/Twist2/Mi2/NuRD蛋白復合物，其與E-box的啟動子結合，下調E-cadherin的表達，導致了EMT的發生，這同樣可能是喉鱗狀細胞癌侵襲和轉移的途徑之一。本研究結果同時顯示：Dermol的表達率越高，E-catenin的表達率越低，喉鱗癌的侵襲、轉移能力越強，Dermol蛋白表達與E-catenin的表達呈明顯負相關（r = -0.344，P = 0.034）。由此可推測：Dermol的過度表達可能引起了E-cadherin表達的下調，兩者協同促進了EMT的發生，導致了喉鱗狀細胞癌的發生和侵襲。同時檢測喉鱗狀細胞癌中Dermol和E-catenin的表達可能有助于對腫瘤進展風險性的分級。此次研究尚未涉及喉鱗狀細胞癌患者的預后及5年生存率，Dermol在喉鱗狀細胞癌中的調控機制及與患者預后及生存率的關系有待進一步研究。

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（收稿日期：2015-04-24 本文編輯：任 念）