缺血性腦卒中與4—羥基壬烯醛的相關性研究

常靜　馬明　林莉莉

[摘要] 目的 探討缺血性腦卒中與4-羥基壬烯醛（4-HNE）的相關性。 方法 選擇腦卒中傾向的自發性高血壓大鼠和自發性高血壓大鼠，檢測4-HNE在大腦皮層和血清中的表達水平，觀察其與大鼠生存時間的關系；同時檢測缺血性腦卒中患者和對照人群血漿4-HNE水平及其在急性期和慢性期的變化。 結果 與自發性高血壓大鼠相比，腦卒中傾向的自發性高血壓大鼠大腦皮層和血清的4-HNE表達明顯升高（P < 0.01），且4-HNE水平與大鼠生存時間呈負相關（r=-0.602 08，P < 0.01）；腦卒中患者血漿4-HNE水平較正常人群升高（P < 0.01），且慢性期患者較急性期患者有降低的趨勢（P < 0.05）。 結論 缺血性腦卒中時4-HNE升高，4-HNE水平與缺血性腦卒中具有相關性。

[關鍵詞] 4-羥基壬烯醛；缺血性腦卒中；腦卒中傾向自發性高血壓大鼠

[中圖分類號] R363 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）09（c）-0026-04

[Abstract] Objective To investigate the correlation between ischemic stroke and 4-hydroxynonenal （4-HNE）. Methods Stroke prone spontaneously hypertensive rat （SHR-SP） and spontaneously hypertensive rat （SHR） were observed in this research. 4-HNE was detected in cerebral cortex and serum， and the relationship between 4-HNE level and lifespan was observed. Also the changes of plasma 4-HNE in patient with ischemic stroke in acute-period and chronic-period and control person were detected. Results Compared to SHR rats， the cortex and serum 4-HNE levels were significantly higher in SHR-SP rats （P < 0.01）. Serum 4-HNE level significantly and inversely correlated with the survival time of SHR-SP （r=-0.602 08，P < 0.01）. Stroke patients in acute period and chronic period had significantly elevated levels of 4-HNE than the control subjects （P < 0.01）. 4-HNE in chronic stroke patients was lower than acute stroke patients （P < 0.05）. Conclusion 4-HNE increases in ischemic stroke and there is a correlation between ischemic stroke and 4-HNE.

[Key words] 4-hydroxynonenal； Ischemic stroke； Stroke prone spontaneously hypertensive rat

腦缺血時病理過程極為復雜，缺血損傷后腦組織發生能量代謝紊亂、中樞神經遞質紊亂、氧化應激損傷、炎性反應等改變，使神經元發生復雜病理生理改變而凋亡[1-3]。近年來，氧化應激學說已成為缺血性卒中研究的熱點，缺氧可使組織生成大量氧自由基，作用于細胞膜上的不飽和脂肪酸，使膜脂質產生過氧化反應，進而導致細胞損傷，并形成脂質過氧化物。4-羥基壬烯醛（4-hydroxynonenal，4-HNE）是脂質過氧化反應醛基產物中最具代表性的物質[4]，在腦缺血時4-HNE如何變化，其是否是腦缺血損傷的危險因素？目前研究甚少，本課題就缺血性腦卒中與4-HNE的相關性進行了基礎和臨床研究，對臨床采取有效的防治措施有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

雄性京都種大鼠（Wistar Kyoto rat，WKY rat），體重250～300 g，購自上海斯萊克動物實驗中心，清潔級，動物合格證號SCXK（滬）2007-0005；自發性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rat，SHR）以及腦卒中傾向的自發性高血壓大鼠（stroke prone spontaneously hypertensive rat，SHR-SP）均由第二軍醫大學藥理教研室贈予。4-HNE標準品和人4-HNE一抗購自Sigma公司，大鼠4-HNE酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒購自WEIAO生物技術有限公司。實驗動物按種屬不同分為WKY組、SHR組和SHR-SP組。

1.2 人群選擇

以無錫市人民醫院腦梗死發生后0～3 d為腦卒中急性期患者（23例），腦梗死發生后3～6個月為慢性期患者（13例），以年齡、性別等基本社會特征及健康信息相匹配人群為對照（30名），觀察腦梗死患者及對照人群血漿4-HNE水平。

1.3 Western blot分析

取6月齡WKY、SHR和SHR-SP大鼠的大腦皮層組織，提取蛋白定量后，各組取等量蛋白加入上樣緩沖液并變性，行SDS-PAGE垂直電泳、轉膜、牛奶封閉，分別加4-HNE一抗（內參照為GAPDH抗體），4℃孵育過夜，二抗孵育，奧德賽紅外掃膜儀掃描定量，觀察4-HNE在WKY、SHR和SHR-SP大鼠大腦皮層中的表達。

1.4 大鼠血清4-HNE檢測

3、6月齡大鼠眼眶取血約1.5 mL，3000 r/min離心15 min，取上清。每孔加入底物工作液100 μL和酶標抗體工作液10 μL，各孔加入標準品或待測樣品20 μL。振蕩混勻后將反應板置37℃ 15 min后，每孔加入100 μL終止液，混勻，30 min內用酶標儀在490 nm處測吸光值。以標準品4000、2000、1000、500、250、125、62.5、0 ng/mL為橫坐標，OD值為縱坐標，繪出標準曲線。根據樣品OD值計算出相應4-HNE含量。

1.5 人血漿中4-HNE檢測

BCA測定血漿蛋白濃度，用PBS調整濃度至10 μg/mL。每孔加入100 μL樣品或標準品，4℃過夜，PBS清洗3次，甩干；每孔再加入200 μL Assay Diluent，搖床搖晃1～2 h，Wash Buffer 清洗3次，甩干；每孔加入100 μL抗4-HNE抗體，室溫孵育1 h，PBS清洗3次，每孔加入100 μL二抗HRP conjugate，室溫孵育1 h，PBS清洗3次；每孔加入100 μL底物反應液，孵育10 min。密切觀察顏色變化，當顏色變化很快時，立即加入100 μL反應終止液。立即置于酶標儀上，450 nm處讀取吸光度值，根據標準曲線計算出樣品4-HNE濃度。

1.6 統計學方法

采用SPSS 16.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；采用Pearson相關進行相關性分析。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 4-HNE在WKY、SHR和SHR-SP大鼠大腦皮層中的表達

雄性SHR-SP一般在8～12月齡內會發生腦卒中而死亡，其中75%是缺血性腦卒中。利用Western blot的方法測定6月齡的WKY、SHR、SHR-SP大鼠大腦皮層4-HNE的表達，結果顯示，與WKY相比，SHR-SP大鼠大腦皮層4-HNE表達增高[（1.000±0.093）比（1.180±0.125）]，差異有統計學意義（P < 0.05）；與SHR相比，SHR-SP大鼠大腦皮層4-HNE表達顯著增高[（0.910±0.113）比（1.180±0.125）]，差異有高度統計學意義（P < 0.01），而SHR與WKY相比，差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖1。

2.2 WKY、SHR和SHR-SP大鼠血清4-HNE水平比較

本研究分別檢測了3月齡和6月齡的WKY、SHR、SHR-SP三種大鼠外周血清中4-HNE的含量，結果顯示，不管是3月齡還是6月齡，SHR-SP大鼠的血清4-HNE水平較SHR與WKY大鼠均顯著升高[3月齡SHR-SP、SHR、WKY大鼠4-HNE水平分別為（963.8±144.7）、（318.6±55.7）、（330.9±40.9）ng/mL，P < 0.01；6月齡SHR-SP、SHR、WKY大鼠4-HNE水平分別為（1392.1±200.9）、（444.5±178.1）、（330.9±40.9）ng/mL，P < 0.01]，而SHR與WKY大鼠血清4-HNE水平差異無統計學意義（P > 0.05）。隨著SHR-SP大鼠月齡的增長，血清4-HNE的水平也逐漸升高，6月齡大鼠較3月齡相比，差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖2。

2.3 4-HNE水平與SHR-SP大鼠生存時間的相關性

27只8月齡雄性SHR-SP大鼠眼眶取血，測定血清4-HNE水平，動物放回動物房繼續飼養，記錄死亡情況。統計4-HNE與SHR-SP大鼠生存時間的相關性。結果顯示，SHR-SP大鼠的生存時間與血漿4-HNE水平呈負相關（r=-0.602 08，P=0.0009）。見圖3。

2.4 缺血性腦卒中患者血漿4-HNE水平

通過臨床進一步觀察4-HNE與腦卒中的關系，以年齡、血壓、血脂等基本信息相匹配人群為對照，測定缺血性腦卒中急性期（0～3 d，23例）和慢性期（3～6個月，13例）患者及對照人群血漿4-HNE水平。結果顯示，各人群組間總膽固醇及肌酐差異有統計學意義（P < 0.05），但總膽固醇與肌酐水平均在正常范圍內。見表1。不管是急性期還是慢性期，腦卒中患者血漿4-HNE水平均高于對照人群[（14.9±2.5）、（12.9±2.6）比（9.6±2.0）mg/mL]，差異有高度統計學意義（P < 0.01）；慢性期患者血漿4-HNE水平較急性期低，差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖4。

3 討論

氧化應激是腦缺血的基本病理生理改變之一，腦缺血缺氧時，體內或細胞內活性氧的產生與抗氧化之間失衡，導致活性氧在體內蓄積，并引起一系列生物反應的過程。過多的氧自由基攻擊生物膜磷脂中的多不飽和脂肪酸引發脂質過氧化反應[5]。研究發現，ω-6多不飽和脂肪酸，如亞油酸和花生四烯酸可以分解為4-HNE[6]，與自由基相比，醛基產物更穩定，醛基還可與親核性物質（如DNA、蛋白質和磷脂）反應，干擾細胞的正常功能，損傷細胞組分，從而引發疾病[7-9]。

多項研究證實，過多的4-HNE通過多種途徑對細胞產生嚴重的生物毒性，如4-HNE能對含巰基蛋白質相關的位點進行修飾，引起蛋白質分子內和分子間交聯，抑制蛋白、DNA合成，或改變酶活性[10-11]；4-HNE也可以作為內源性凋亡誘導因子，抑制AKP等信號通路而誘發細胞凋亡作用[12-13]；4-HNE與細胞內谷胱甘肽的巰基結合，造成谷胱甘肽消耗性降低，使細胞內抗氧化能力減弱，進一步并加重細胞內的氧化應激[14-15]；4-HNE作為脂質過氧化的終末產物，能誘導巨噬細胞聚集活化，誘導炎癥因子表達，促進炎癥的發生[16-17]。上述機制使4-HNE參與多種疾病的發生、發展。近年來尚有研究表明，在心肌缺血的病理情況下，血漿4-HNE明顯升高，提示4-HNE與缺血性疾病的發生密切相關[18-19]。

SHR-SP和SHR大鼠均來自WKY大鼠，雄性的SHR-SP大鼠在5～12周齡時血壓快速上升，形成嚴重的高血壓，75%左右的SHR-SP大鼠因缺血性腦卒中而死亡[20]。通過對比6月齡的SHR-SP、SHR和WKY大鼠發現，SHR-SP大鼠大腦皮層4-HNE水平明顯高于SHR和WKY大鼠，但SHR和WKY大鼠無明顯區別，血漿中4-HNE水平也呈現同樣趨勢，且隨年齡增長而升高。4-HNE僅在SHR-SP大鼠中升高，這意味著4-HNE的改變與血壓無明顯關系，4-HNE的增加可能會促進腦卒中發生。

腦缺血后，腦內氧化應激增加，代謝紊亂，4-HNE、丙二醛（MDA）等物質大量增加，被認為是缺血性腦卒中的結果。研究發現，SHR-SP大鼠血清4-HNE水平在腦卒中發生前就開始升高，一直到卒中后恢復期逐漸下降，但短期內難以降至正常水平；大腦皮層的4-HNE也在腦卒中發生前表達上調，較SHR和WKY大鼠均有顯著差異，且與SHR-SP大鼠生存時間呈負相關[20]。本研究發現，缺血性腦卒中患者，無論急性期還是慢性期，血漿4-HNE水平均高于正常人群，即使在卒中發生后幾個月仍維持在較高的水平；隨時間推移，4-HNE逐漸下降，慢性期患者血漿的4-HNE水平比急性期患者低。基于這些可以認為，血漿4-HNE可能是缺血性腦卒中發生的危險因素之一。當然，這還有待更廣泛和深入的研究，下一步研究將通過檢測志愿者血漿4-HNE水平，隨訪志愿者腦卒中的發生率，觀察是否高水平4-HNE的人群更容易發生腦卒中。對于腦卒中的高危人群（高血壓、腦卒中家族史及60歲以上老年人）監測其血漿4-HNE具有積極的臨床意義，可以作為預測腦卒中發生的一個指標。

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（收稿日期：2015-06-03 本文編輯：程 銘）