辣椒油樹脂中羅丹明B檢測方法對比研究

韓文杰，蔡榮華，童玉海

（晨光生物科技集團莎車有限公司，新疆喀什844400）

辣椒油樹脂中羅丹明B檢測方法對比研究

韓文杰，蔡榮華*，童玉海

（晨光生物科技集團莎車有限公司，新疆喀什844400）

對辣椒油樹脂中羅丹明B的兩種常見檢測方法高效液相色譜-熒光檢測法和高效液相色譜-串聯質譜法進行了對比研究，就兩種檢測方法的線性、精密度、回收率、穩定性、適用性等方面進行對比試驗，結果表明：兩種檢測方法精密度和準確度都很高，均能準確定量。但是高效液相色譜-串聯質譜檢測方法檢測方法簡單快捷，適合快速測定樣品中羅丹明B的含量，但是檢測費用較高，對儀器和人員的要求水平也比較高，很難在中小企業普及；而高效液相色譜-熒光檢測方法費用一般，檢測方法穩定，針對性強，檢測信號干擾較少，結果相對更準確，為中小企業和食品監督檢驗機構提供一種簡單易行的方法。所以高效液相色譜-熒光檢測法檢測成本較低，更適用于企業生產中的規模化檢測；高效液相色譜-串聯質譜法適用于特殊情況下的快速定性定量檢測。

辣椒油樹脂；羅丹明B；檢測方法；對比研究

辣椒油樹脂（capsicum oleoresin）是從辣椒中提取、濃縮而得到的一種油狀液體，是辣椒素和辣椒紅色素提取過程中的重要中間產物。辣椒油樹脂除了含有辣椒的辛辣成分（Capsaicinoids）外，還含有辣椒醇、蛋白、果膠、多糖、辣椒色素等不少于100余種其他的化學物質［1］。辣椒油樹脂主要用在調味品、醫療、生化農藥、軍事等方面，其價值日漸被人們所重視。

羅丹明B（Rhodamine B），又名玫瑰紅B、堿性玫瑰精、蕊香紅B，俗稱花粉紅。是一種人工合成堿性熒光染料，由堿羥基二乙基苯胺與鄰苯二甲酐縮合制的，分子式C28H31CLN2O3；分子量479.017 5；常溫下為綠色結晶或紅紫色粉末，幾乎無異味；水溶液為藍紅色，稀釋后有強烈熒光，主要用于造紙、制漆、紡織等的工業染色。由于羅丹明B具有價格低廉、色澤紅艷、穩定性強等特點，常被不法商家用作替代食品添加劑的著色劑，給人們的飲食安全帶來極大隱患［2］。故采用合理的方法，檢測天然辣椒油樹脂中羅丹明B的方法，尤為重要。

現辣椒油樹脂中羅丹明B的檢測方法較多，主要有高效液相色譜-熒光檢測法［3-9］、高效液相串聯質譜法、高效液相色譜-紫外檢測法等［10-13］。關于此類檢測方法已多有報道，但對其進行對比研究的文獻較少，對適于不同實驗條件下的相關闡述也不多。國家質量監督檢驗檢疫總局對食品中羅丹明B的檢測［14］提供了高效液相色譜（配熒光檢測器）法、高效液相串聯質譜法兩種檢測方法，本論文就兩種檢測方法的線性、精密度、回收率、穩定性、適用性等方面進行對比試驗，目的是為建立辣椒油樹脂中羅丹明B的多種檢測方法體系，尋找最合適的辣椒油樹脂中羅丹明B的檢測方法。

1材料與方法

1.1試劑與材料

實驗用原料：辣椒油樹脂，晨光生物科技集團股份有限公司提供。

羅丹明B標準品：潤生科研試劑；甲醇（色譜級）、乙酸乙酯（分析純）、環己烷（安徽時聯特種溶劑有限公司，分析純）。

1.2儀器設備

凝膠滲透色譜儀（GPC）：WATERS公司；高效液相色譜儀（HPLC）配熒光檢測器：安捷倫科技公司；分析天平（精確到0.000 1 g）：日本島津公司；三重四級桿串聯質譜儀：美國Waters公司；超純水儀：上海和泰儀器有限公司；XW-80A漩渦混合器：上海精科實業有限公司；HS3120超聲波清洗儀：天津恒奧科技發展有限公司；H-2050R超高速冷凍離心機：長沙湘儀離心機有限公司。

1.3色譜條件

1.3.1高效液相色譜-熒光檢測法色譜條件

色譜柱：ODS C18柱（250 mm×4.6 mm，5 m）；熒光檢測器，激發波長：550 nm；發射波長：580 nm；流動相：乙腈∶水=50∶50，每1 L流動相加入0.77 g乙酸銨；流速：1.0 mL/min；柱溫箱溫度：40℃；進樣量：10 μL。

1.3.2高效液相色譜-串聯質譜的色譜條件

1）儀器條件：離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描模式：正離子掃描（ESI+）；檢測模式：MRM多反應監測；毛細管電壓：1.0 kV；萃取錐孔電壓：3.0 V；RF透鏡電壓：0.0 V；離子源溫度：120℃；脫溶劑氣溫度：420℃；脫溶劑氣流量：700 L/h；錐孔反吹氣流量：50 L/h。

2）檢測條件：色譜柱：C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相：甲醇-0.2%甲酸，流速：0.2 mL/min；柱溫：35℃；進樣量：10 μL。

1.4標樣的制備

將購買100 mg/kg的標準品1 mL完全溶解到100 mL容量瓶中，加入色譜純甲醇定容，搖勻使之完全溶解，制作成濃度為1 mg/kg儲備液。

每次檢測時將儲備液稀釋至5 μg/kg，進樣后根據標樣峰面積進行標準曲線定量。

1.5樣品的制備

將2批辣椒油樹脂加標樣品（A和B，辣椒素含量約50%，羅丹明B加標量分別為70 μg/kg和22 μg/kg）分別用植物油稀釋至辣椒素含量1.0%、3.0%和5.0%水平，共6個樣品。

1）高效液相色譜-熒光檢測法的前處理：精確稱取1.00 g樣品于10 mL容量瓶中，加入GPC流動相（環己烷∶乙酸乙酯=1∶1）定容，超聲溶解，混合均勻。用一次性注射器吸取，過0.45 μm濾膜到小玻璃管中，不少于6 mL。將裝有樣品的小管放在GPC樣品架上，過GPC，收集于100 mL小燒瓶中。將小燒瓶在旋蒸上，于50℃濃縮近干。在小燒瓶內加入1 mL色譜甲醇定容，超聲溶解，待測。

2）高效液相色譜-串聯質譜檢測方法的前處理：準確稱取1.00 g樣品于50 mL具塞離心管中，一式兩份，各加10mL甲醇。旋渦均質2min，然后超聲提取10min；之后在5℃下以10 000 r/min離心5 min，取上層清液約1 mL，過0.22 μm的有機濾膜裝入2 mL的進樣小瓶中，待檢測。

1.6計算公式

用數據處理軟件中的外標法，或繪制標準曲線，按公式計算試樣中羅丹明B的含量。

式中：X為試樣中羅丹明B的含量，（μg/kg）；c為由標準曲線得到的樣液中羅丹明B的濃度，（μg/mL）；c0為由標準曲線得到的空白實驗中羅丹明B的濃度，（μg/mL）；v為樣液最終定容體積，mL；m為最終樣液所代表的試樣質量，g。

2結果與討論

2.1色譜圖

2.2線性關系

圖1　標準溶液分別用高效液相色譜-熒光檢測（上）和高效液相色譜-串聯質譜檢測（下）圖譜Fig.1HPLC-Fluorescence detecting（up）HPLC-tandem mass spectrometry（down）

按照1.3的色譜條件，將1.4所配的標準溶液分別用兩種檢測方法進行檢測，以峰面積對溶液濃度進行線性回歸，得到兩種檢測方法的標準曲線。高效液相色譜-熒光檢測的標準曲線：Y=51 362.7X+103.3，r=0.999 9，在0.1 μg/kg～300 μg/kg范圍內線性關系良好；高效液相色譜-串聯質譜檢測的標準曲線：Y= 67 911.4X+1 052.2，r=0.999 2，在0.1 μg/kg～10 μg/kg范圍內線性關系良好。結果表明高效液相色譜-熒光檢測較高效液相色譜-串聯質譜有相對寬的線性范圍。

2.3精密度實驗

取同一辣椒油樹脂樣品，分別用兩種檢測方法各平行檢測5次，分別計算羅丹明B的含量，如表1所示，兩種檢測方法的RSD均小于10%，因此兩種檢測方法都滿足檢測需求。

表1　精密度實驗結果（n=5）Table 1The precision experimental results（n=5）

2.4加標回收率實驗

將理論值為3.0、5.0、25.0、50.0、100.0、200.0 μg/kg羅丹明B標準液分別加入到樣品中，按照1.3和1.5的檢測方法檢測，分別計算兩種檢測方法的加標回收率，結果見表2。

兩種檢測方法的加標回收率都在99.89%～114.81%之間，表明兩種檢測檢測辣椒油樹脂中羅丹明B的準確度都比較高，均可準確定量檢測辣椒油樹脂中羅丹明B的含量。

表2　加標回收率數據表Table 2Standard addition recovery data table

2.5穩定性實驗

取同一批辣椒油樹脂樣品，每天按照1.5方法對樣品進行前處理，分別使用兩種方法檢測樣品中羅丹明B含量，連續測定10 d，分別計算前3日、5日和10日內的檢測結果的日間RSD，結果見表3。

表3　穩定性實驗結果Table 3The stable experimental results

在前5日內，兩種檢測方法在3日內的日間精密度都＜5%，但高效液相色譜-串聯質譜檢測方法在5內日和10日內日間精密度明顯變大，高效液相色譜-熒光檢測方法基本保持不變。表明兩種方法雖然都能滿足檢測要求，但明顯的高效液相色譜-熒光檢測方法相對更穩定，分析原因高效液相色譜-熒光檢測方法的前處理使用凝膠色譜儀進行雜質的去除，對檢測信號干擾比較小，檢測的數值比較準確，而高效液相色譜-串聯質譜檢測方法前處理沒有除雜，直接將樣品稀釋進行檢測，雜質對檢測結果的干擾比較大，造成檢測結果不穩定。

2.6樣品檢測對比

取5批不同的辣椒油樹脂樣品，按照1.5的處理過程，同時采取兩種方法檢測，結果顯示樣品中羅丹明B的含量基本一致。從整體檢測時間來看，高效液相色譜-熒光檢測方法前處理因要使用GPC凈化，需要1 h，濃縮需要0.5 h，且樣品在液相色譜-熒光檢測出峰時間為5 min左右，檢測過程較長，而高效液相色譜-串聯質譜檢測前處理時間需要20 min左右，在質譜上出峰時間1.5 min左右，簡單快捷。從檢測準確性來比較，高效液相色譜-熒光檢測方法結果穩定準確，不需要做平行樣，而高效液相色譜-串聯質譜檢測方法每次需要做平行樣，監控檢測的穩定性。從檢測成本對比，高效液相色譜-串聯質譜檢測方法對儀器和檢測人員的要求都比較高，特別是質譜檢測儀成本較高，中小企業難以普及，而液相色譜儀廣大中小企業都有，便于食品質量的控制，做好食品安全的保護工作。

3結論

1）通過對兩種檢測方法的對比研究，高效液相色譜-熒光檢測方法和高效液相色譜-串聯質譜檢測方法對于辣椒油樹脂中羅丹明B的含量檢測準確度和精密度相當，均能準確定量。

2）高效液相色譜-熒光檢測方法比高效液相色譜-串聯質譜檢測方法穩定，針對性強，檢測信號干擾較少，結果相對更準確。

3）高效液相色譜-串聯質譜檢測方法檢測方法簡單快捷，適合快速測定樣品中羅丹明B的含量，但是檢測費用較高，對儀器和人員的要求水平也比較高，很難在中小企業普及，而高效液相色譜-熒光檢測方法費用一般，檢測準確，為中小企業和食品監督檢驗機構提供一種簡單易行的方法。

［1］陳蔡君，萬佳.辣椒油樹脂、辣椒紅素、辣椒素提取工藝研究［J］.食品研究與開發，2013，34（17）:30-33

［2］陳艷美，于淼.羅丹明B染色食品對人體的危害及檢測［J］.科學之友，2011（18）:153-157

［3］林長虹，胡書玉，黃達鍇，等.辣椒及其制品中羅丹明B的超高效液相色譜熒光檢測［J］.廣東化工，2011，38（4）:140-141

［4］占立明，夏愛萍，張旭，等.高效液相色譜法測定辣椒粉中羅丹明B的含量［J］.農業機械，2012（36）:107-109

［5］楊仁惠，胡立立，許乾麗，等.高效液相色譜熒光檢測法測定辣椒制品中羅丹明B的含量［J］.現代醫藥衛生，2013，29（4）:481-482，485

［6］湯建春，龍朝陽，許秀敏，等.高效液相色譜熒光檢測法測定辣椒油、辣椒粉、火鍋底料中的羅丹明B染料［J］.中國衛生檢驗雜志，2011，21（12）:2843-2844

［7］楊桂玲，孟冰冰，于林.液相色譜串聯質譜法檢測辣椒制品中羅丹明B的含量［J］.中國調味品，2013，38（5）:108-110，120

［8］繆璐，郭振華，莫佳琳，等.超高效液相色譜熒光法檢測調味品中羅丹明B殘留量［J］.廣州化學，2011，36（3）:17-21

［9］王傳現，韓麗，方曉明，等.食品中羅丹明B的高效液相色譜熒光檢測［J］.分析儀器，2008（1）:27-30

［10］楊桂玲，孟冰冰，王業菊，等.液相色譜串聯質譜法檢測辣椒制品中羅丹明B的含量［A］.中國食品科學技術學會.中國食品科學技術學會第九屆年會論文摘要集［C］.中國食品科學技術學會，2012:2

［11］周鵬，余清，林欽，等.液質聯用法測定辣椒紅色素中羅丹明B含量［J］.食品研究與開發，2013，34（4）:74-76，113

［12］胡俠.食品中羅丹明類染料的高效液相色譜及高效液相色譜—串聯質譜分析方法的研究［D］.大連理工大學，2010:1

［13］胡俠，肖光，潘煒，等.高效液相色譜-串聯質譜法同時測定辣椒粉及辣椒油中的7種羅丹明染料［J］.色譜，2010（6）:590-595

［14］王國民，李賢良，張雷，等.SN/T 2430-2010，進出口食品中羅丹明B的檢測方法［S］.山東:山東省標準文化研究院，2010:26

The Comparative Study of Rhodamine B Detection Method in Capsicum Oleoresin

HAN Wen-jie，CAI Rong-hua*，TONG Yu-hai
（Chenguang Biotech Group Shache Co，Ltd，Kashi 844400，Xinjiang，China）

In this paper，two common method namely high performance liquid chromatography（HPLC）with fluorescence method and high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry of rhodamine B in Capsicum Oleoresin has carried on the comparative study，Comparing on linear，precision，recovery，stability，serviceability etc in the compared test of two detection methods.The results show：two detecting methods have a same high degree of precision and accuracy and can accurately quantify.However，HPLC-tandem mass spectrometry method is simple and quick that for the rapid determination of rhodamine B sample，but this method need the high cost of testing and equipment and personnel requirements is relatively high，so it is difficult to spread in the SME；The cost of HPLC-fluorescence detection method is in general and the method is stable，targeted and has the less signal interference，so relativly it has more accurate results，to provide a simple way for small and medium enterprises and food supervision and inspection agencies.So HPLC-fluorescence detection need lower testing costs，and is more suitable for the large-scale testing of the production；HPLC-tandem mass spectrometry is for rapid qualitative and quantitative determination in the special circumstances.

capsicum oleoresin；rhodamine B；detection method；comparative study

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.14.027

2014-03-03

韓文杰（1968—），男（漢），工程師，本科，研究方向：天然產物提取分離技術的研究。

蔡榮華（1985—），女（漢），助理工程師，本科，研究方向：天然植物提取研究與開發。