γ-聚谷氨酸發酵工藝研究

李宏杰，方軍，蔣彩霞，沈康

（杭州中美華東制藥有限公司，浙江杭州310011）

γ-聚谷氨酸發酵工藝研究

李宏杰，方軍，蔣彩霞，沈康

（杭州中美華東制藥有限公司，浙江杭州310011）

采用發酵技術，利用枯草芽孢桿菌發酵生產γ-聚谷氨酸，對γ-聚谷氨酸發酵工藝進行研究。主要研究碳源、氮源、裝液量、接種量、發酵時間、pH以及前體谷氨酸鈉和促進劑氯化銨對γ-聚谷氨酸發酵的影響。前期研究表明，γ-聚谷氨酸發酵液黏度與其產量線性相關，故本研究中采用發酵液黏度作為γ-聚谷氨酸產量的衡量指標。通過單因素試驗和正交試驗，對發酵培養基和發酵條件進行優化，最后得到最佳發酵培養基配方和發酵條件。通過單因素及正交試驗，確定最佳發酵培養基配方為：葡萄糖4%，酵母膏0.5%，谷氨酸鈉3%，MgSO4·7H2O 0.025%，K2HPO40.2%，氯化銨0.3%；最佳發酵條件為：初始pH 9.5，裝液量50mL，接種量6%，搖床轉速為220 r/min，37℃振蕩培養72 h。

γ-聚谷氨酸；枯草芽孢桿菌；發酵工藝

γ-聚谷氨酸（γ-Poly glutamic acid，γ-PGA）是由L-谷氨酸（L-Glu）、D-谷氨酸（D-Glu）單體通過γ-羧基與α-氨基間的γ-酰胺鍵聚合而成的一種多肽分子。由于其具有增稠、乳化、成膜、保濕、絮凝、粘合、無毒、水溶、生物可降解、無毒副作用等特性，適用于食品、化妝品、生物醫學、環境保護等領域。近年來隨著對γ-聚谷氨酸的深入研究，作為一種新型的高分子生物制品，愈來愈顯現出廣闊的研究及應用前景。本課題擬對γ-聚谷氨酸進行發酵生產，主要對γ-聚谷氨酸發酵工藝進行研究，旨在提高γ-聚谷氨酸產量，為γ-聚谷氨酸工業化生產提供技術參考。

1材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1主要化學試劑

葡萄糖、蔗糖、檸檬酸、可溶性淀粉、牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、谷氨酸鈉、氯化銨等均為市購。

1.1.2主要儀器

電子天平TE612-L：北京賽多利斯儀器系統有限公司；手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器SYQ-DSX-280：上海申安醫療器械廠；超凈工作臺SW-CJ-1F：蘇州江東精密儀器有限公司；電熱恒溫培養箱DPX-9082B-1型：上海福瑪實驗設備有限公司；流變儀DV-III：美國Brookfield公司等。

1.1.3試驗菌種

試驗菌種：枯草芽孢桿菌，杭州中美華東制藥有限公司實驗室保存。

1.1.4培養基

1）斜面培養基（LB培養基）：蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，NaCl 0.5%，葡萄糖0.1%，瓊脂2%，酵母粉0.2%，pH 7.5；滅菌條件：121℃，20 min。

2）種子培養基：葡萄糖2%，酵母膏0.5%，谷氨酸鈉2%，MgSO4·7H2O 0.025%，K2HPO40.2%，pH 7.5；滅菌條件：121℃，20 min。

3）發酵培養基：葡萄糖4%，酵母膏0.8%，谷氨酸鈉3%，MgSO4·7H2O 0.025%，K2HPO40.2%，pH 7.5；滅菌條件：121℃，20 min。參考，待優化。

1.2培養方法

斜面培養：挑取枯草芽孢桿菌保藏菌種接種于斜面培養基中，37℃靜置培養13 h～24 h，作為一次活化菌種。將一次活化菌種接種于新鮮斜面培養基中，37℃下靜置培養13 h～24 h，作為二次活化菌種。

種子培養：將二次活化菌種接種于種子培養基，37℃、220 r/min，振蕩培養16 h～24 h作種子液。

發酵培養：按所需的接種量將種子液接種于發酵培養基中，37℃、220 r/min，振蕩培養48 h，得到含有γ-聚谷氨酸的發酵液。

1.3試驗方案

1.3.1單因素試驗優化發酵培養基

1）碳源：考察不同碳源碳源對γ-聚谷氨酸產量的影響，碳源分別為葡萄糖、蔗糖、檸檬酸、可溶性淀粉，其他條件相同，每組試驗3個平行和1個空白。測定發酵液的黏度［4］，確定最佳碳源。

2）氮源：考察不同氮源對γ-聚谷氨酸產量的影響，氮源分別為牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、豆餅粉、固體豆漿，其他條件相同，每組試驗3個平行和一個空白。測定發酵液的黏度，確定最佳碳源。

3）谷氨酸鈉含量：考察不同谷氨酸鈉含量對γ-聚谷氨酸產量的影響，其含量分別為0、1%、2%、3%、4%，其他條件相同，每組試驗3個平行。測定發酵液黏度，確定最適谷氨酸鈉含量。

4）氯化銨含量：考察不同氯化銨含量對γ-聚谷氨酸產量的影響，其含量分別為0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%，其他條件相同，每組試驗3個平行。測定發酵液黏度，確定最適氯化銨含量。

1.3.2單因素試驗優化發酵條件

1）初始pH：考察不同初始pH對γ-聚谷氨酸產量的影響，pH分別為6、7、8、9，其他條件相同，每組實驗3個平行。測定發酵液黏度，確定最適pH的范圍。

2）接種量：考察不同的接種量對γ-聚谷氨酸產量的影響，接種量分別為2%、3%、5%、7%、10%其他條件相同，每組試驗3個平行。測定發酵液黏度，確定最適接種量范圍。

3）裝液量：考察不同的裝液量對γ-聚谷氨酸產量的影響，裝液量分別為30、50、70、100 mL其他條件相同，每組試驗3個平行和1個空白。測定發酵液黏度，確定最適裝液量的范圍。

4）發酵時間：考察不同的發酵時間對γ-聚谷氨酸產量的影響，發酵時間分別為24、48、72、96 h，其他條件相同，每組試驗3個平行和1個空白。測定發酵液黏度，確定最適裝液量的范圍。

1.4正交試驗發酵工藝優化

1.4.1正交試驗對發酵培養基成分配比進行優化

本實驗對單因素試驗發酵培養基的最佳碳源（A）、谷氨酸鈉含量（B）和氮源（C）做其配比的正交實驗（三因素三水平）。其他條件相同，每組實驗3個平行，測定發酵液黏度，確定最佳培養基成分。

1.4.2正交試驗對發酵條件進行優化

本實驗對單因素試驗中最佳培養基起始pH（A）、裝液量（B）、接種量（C）和發酵時間（D）做正交試驗（四因素三水平），其他有條件相同，每組實驗3個平行，測定發酵液黏度，確定最佳發酵條件。

2結果

2.1單因素試驗結果

2.1.1單因素試驗優化發酵培養基

按1.4.1所述方法分別研究碳源、氮源、谷氨酸鈉含量、氯化銨含量對γ-聚谷氨酸產量的影響，結果如圖1、圖2、圖3、圖4所示。

圖1　碳源對γ-聚谷氨酸產量的影響Fig.1Effects of carbon sources on the γ-PGA Production

圖2　氮源對γ-聚谷氨酸產量的影響Fig.2Effects of Nitrogen sources on the γ-PGA production

圖3　谷氨酸鈉含量對γ-聚谷氨酸產量的影響Fig.3Effects of Monosodium glutamate on the γ-PGA Production

圖4　氯化銨含量對γ-聚谷氨酸產量的影響Fig.4Effects of NH4Cl on the γ-PGA production

由圖可知，最佳碳源為葡萄糖，則最佳氮源為酵母膏，最佳谷氨酸鈉含量為3%，最佳氯化銨含量為0.3%。

2.1.2單因素試驗優化發酵條件

按1.4.1所述方法分別研究初始pH、接種量、裝液量、發酵時間對γ-聚谷氨酸產量的影響，結果如圖5、圖6、圖7、圖8所示。

由圖可知，最佳初始pH為9，最佳接種量為5%，最佳裝液量為50 mL，最佳發酵時間為72 h。

2.2正交試驗發酵工藝優化結果

2.2.1正交試驗對發酵培養基成分配比進行優化

按2.4.1所述方法對發酵培養基成分配比進行優化，因素水平表見表1，結果與分析見表2。

圖5　初始pH對γ-聚谷氨酸產量的影響Fig.5Effects of initial pH on the γ-PGA Production

圖6　接種量對γ-聚谷氨酸產量的影響Fig.6Effects of Inoculation quantity on the γ-PGA production

圖7　裝液量對γ-聚谷氨酸產量的影響Fig.7Effects of Liquid loading on the γ-PGA Production

圖8　發酵時間對γ-聚谷氨酸產量的影響Fig.8Effects of fermentation time on the γ-PGA production

由表2可以看出，B因素是影響指標值的最主要因素，各因素對γ-聚谷氨酸產量影響主次順序為B＞A＞C，最佳組合為A2B2C2，同時相同條件做表2中最佳組合A2B2C3，得到發酵液的黏度分別為2.097 mPa·s和2.103 mPa·s，黏度相差不大，酵母膏的量影響不大，考慮成本，選最佳組合為A2B2C2。

表1　L9（33）正交試驗因素水平表Table 1Factor level L9（33）of the orthogonal test%

表2　L9（33）正交試驗結果Table 2Result of the orthogonal test L9（33）

2.2.2正交試驗對發酵條件進行優化

按1.4.2所述方法對發酵條件進行優化，因素水平見表3，結果與分析見表4。

表3　L9（34）正交試驗因素水平表Table 3Factor level L9（34）of the orthogonal test

由表4可知，C因素是影響指標值的最主要因素，各因素對γ-聚谷氨酸產量影響主次順序為C'＞B＞'A'＞D'，最佳組合為A3'B2'C3'D2'。相同條件做A3'B2'C3'D2'和表4中最佳組合A2'B2'C3'D1'，得到發酵液的黏度分別為1.937mPa·s和1.903mPa·s，則最佳組合為A3'B2'C3'D2'。

表4　L9（34）正交試驗結果Table 4Result of the orthogonal test L9（34）

3結論

通過單因素試驗和正交試驗得到最佳發酵工藝：葡萄糖4%，酵母膏0.5%，谷氨酸鈉3%，MgSO4·7H2O 0.025%，K2HPO40.2%，氯化銨0.3%，初始pH9.5，121℃滅菌20 min，250 mL三角瓶，裝液量50 mL，接種量6%，搖床轉速為220 r/min，37℃振蕩培養72 h。

［1］G G Meynell，E Meynell.The Biosynthesis of Poly d-glutamic Acid apsular Material of Bacillus anthracis［J］.General Microbiology.1966，43（1）:119-128

［2］陳詠竹，孫啟玲.γ-多聚谷氨酸（γ-PGA）生產菌的誘變選育及重金屬吸附的應用研究［D］.四川:四川大學，2005

［3］曹旭，徐志南.γ-多聚氨酸的異源表達及發酵工藝的研究［D］.杭州:浙江大學，2007

［4］李文靖.γ-聚谷氨酸發酵及提取工藝研究［D］.濟南:山東輕工業學院，2010

Study on Fermentation Process of γ-PGA

LI Hong-jie，FANG Jun，JIANG Cai-xia，SHEN Kang
（Hangzhou East China Pharmaceutical Group Co.，Ltd.，Hangzhou，310011，Zhejiang，China）

In this study，the fermentation technology was used to produce γ-PGA with Bacillus subtilis fermentation，and the fermentation process technology of γ-PGA is studied.The influence of the output of γ-PGA was the main researched，such as the carbon source，nitrogen source，liquid volume，inoculation，fermentation time，pH and sodium glutamate precursor and the promoter of ammonium chloride.Previous studies had shown that γ-PGA fermentation broth viscosity linearly related to its production，the viscosity of the fermentation broth was used as γ-PGA output measure.The optimum medium composition and the optimum fermentation conditions scope were determined by single factor experiment orthogonal experiment.The optimum medium of the fermentation obtained through the single factor and orthogonal experiments was：4%glucose，0.5%yeast extract，sodium glutamate 3%，MgSO47H2O 0.025%，K2HPO40.2%，ammonium chloride，0.3%；Optimum fermentation conditions were：initial pH 9.5，medium volume 50mL，inoculum size 6%，rotation speed of 220 r/min，37℃oscillator cultured 72 h.

γ-poly glutamic acid；Bacillus subtilis；fermentation process

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.14.020

2015-02-26

李宏杰（1978—），男（漢），工程師，本科，研究方向：藥物發酵工藝研究。