發酵法制取大豆染料木素的研究

李晶，張樹良，趙冬梅

（天津市紅橋區產品質量監督檢驗所，天津300122）

發酵法制取大豆染料木素的研究

李晶，張樹良，趙冬梅

（天津市紅橋區產品質量監督檢驗所，天津300122）

通過單因素和正交試驗確定，得出納豆芽孢桿菌A-3發酵豆粕產染料木素的最佳條件為8%豆粕添加量，培養溫度為34℃，轉速為180 r/min，培養64 h，pH為7.3，裝液量為50 mL/250 mL，接菌量為10%。最終目的產物染料木素的產率為0.12%，轉化率為89.13%，達到理想水平。

豆粕；發酵；染料木素；培養條件

大豆異黃酮是黃酮類化合物，是大豆生長中形成的一類次級代謝產物，是一種生物活性物質。大豆異黃酮含有九種葡糖苷和三種苷元，染料木素是其中活性功能最高的一種苷元成分，具有雌性激素及抗雌激素性質、抗氧化作用，可以抑制酪氨酸蛋白激酶（PTK）的活性，也可以抑制拓撲異購酶Ⅱ的活性，具有誘發細胞程序性死亡、提高抗癌藥效、抑制血管生成等作用，是一種很有潛力的癌癥化學預防劑，其抗癌作用及機制具有廣泛的應用前景。

染料木苷在生物酶的作用下脫去一個葡萄糖形成染料木素，納豆芽胞桿菌分泌的β-葡萄糖苷酶就具有同樣的作用。本試驗通過液質聯用方法測定，得出納豆芽孢桿菌A-3發酵豆粕在最佳條件下，染料木素的產率和轉化率明顯提高。

1材料與方法

1.1菌種

納豆菌A（BacillusnattoA）、納豆菌B（BacillusnattoB）。

1.2培養基

1.2.1種子培養基

葡萄糖3%，大豆蛋白胨2%，pH7.2～7.4，NaCl1%。

1.2.2斜面培養基

牛肉膏0.5%，大豆蛋白胨0.5%，瓊脂2%，pH7.2～7.4，NaCl 0.5%。

1.2.3發酵產酶培養基

葡萄糖2%，大豆蛋白胨2%，NaCl 1%，MgSO40.05%，CaCl20.01%，pH 7.2～7.4。

1.3儀器與主要原料

全溫振蕩器（型號HZQ-QX）：哈爾濱東聯電子技術開發有限公司；高溫高壓滅菌鍋（型號：MLS-3750）：SANYO Electric Co.，Ltd；三頻數控超聲波清洗器（型號：KQ-200VDV）：昆山市超聲儀器有限公司；液質聯用儀（型號：Xevo-TQD）：美國沃特斯公司；高效液相色譜儀（型號：Agilent1260）：美國安捷倫公司；脫脂豆粕：天津實發冠華生物科技有限公司提供。

1.4菌種篩選

1.4.1菌種純化

挑取納豆菌A和B各一環，分別溶于10 mL無菌水內，配成10-1菌懸液，再逐步稀釋成10-3～10-4的菌懸液，取0.1 mL涂于平板培養24 h。

1.4.2菌種初篩

將納豆菌A和B從平板中分離的20株菌轉接種子培養基34℃培養，24 h后接入發酵產酶培養基進行酶活初測，接種量為10%，利用水楊苷法測定酶活，方法參照葡萄糖苷酶產生菌發酵條件的優化、粗分離及其特征，選出酶活較高的菌株。

1.4.3產酶條件優化

通過對pH、裝液量、溫度、轉速、發酵時間等因素的選擇來優化菌的產酶條件。

1.4.4菌種馴化

制定三級馴化方案。將發酵產酶培養基中的大豆蛋白胨用豆粕替代，替代量分別為2%、4%和6%，將篩選出來的菌株進行逐級馴化，保存于斜面培養基。

1.5發酵培養

將馴化后的菌株轉接至豆粕培養基進行液體深層發酵，通過控制pH、裝液量、溫度、轉速、發酵時間等因素，確定最佳的發酵方案，通過噴霧干燥將發酵液制成粉末，使最終目的產物染料木素產率達到理想值。

1.6測定方法

樣品和標準品均用80%乙醇溶解，料∶液=1∶15，超聲波提取2次，20 min/次，45 Hz，提取液定容到250 mL，再稀釋一定濃度，進行0.45 μm過濾。由于樣品含有其他與目的產品相近的物質，干擾大，雜峰多，因此本試驗采用液質聯用的方法，進一步確定染料木素的含量。

色譜條件：安捷倫C18柱（4.6 mmi.d.×250 mm，5 μm）；柱溫30℃；0.04 mol乙酸胺（乙酸調pH4）∶甲醇=70∶30為流動相；檢測波長260 nm；流速1 mL/min；進樣量20 μL。

2結果與分析

2.1菌種的篩選結果

通過對Natto A和Natto B兩株菌的分離純化，各挑選10株菌進行發酵液的酶活測定，測定結果見表1。

表1　酶活測定結果Table 1Enzyme activity assay results U/mL

從整體來看，Natto A比Natto B的產酶水平要高，其中最高的是Natto A-3，可以選擇該菌進行下一步馴化。另外有個別酶活是負值，據記載是在測酶活過程中，吸光度出現了負值。

2.2納豆菌生長曲線

將馴化后的Natto A-3接入種子培養基，裝液量為50 mL/250 mL，在48 h內每隔4 h取樣利用紫外分光光度計測定生物量，方法參照［納豆菌液體發酵條件的初步研究］結果見圖1。

圖1　Natto A-3生長曲線Fig.1Growth curve of Natto A-3

納豆菌從4 h開始進入對數期，到40h時倒到最大值，后進入平穩期。可見該菌株最佳發酵時間為40 h。

2.3產酶條件優化

2.3.1起始pH對產酶的影響

研究不同pH（7.2、7.3、7.4、7.5）采用產酶發酵培養基配方，其它發酵條件為轉速140 r/min、發酵溫度34℃、裝液量為50 mL/250 mL、發酵時間為48 h對β-葡萄糖苷酶活力的影響，結果見圖2。

圖2　不同pH對β-葡萄糖苷酶活力的影響Fig.2Effect of different pH on the activity of β-glucosidase

由圖2可知，最佳起始pH為7.3，酶活達到39.2 U/mL。

2.3.2不同的裝液量對產酶的影響

研究不同裝液量（20、30、40、50、60 mL）/250 mL采用產酶發酵培養基配方，其它發酵條件不變，對β-葡萄糖苷酶活力的影響，結果見圖3。

圖3　不同裝液量對β-葡萄糖苷酶活力的影響Fig.3Effect of different liquid loading on the activity of β-glucosidase

由圖3可知，最佳裝液量為40 mL/250 mL三角瓶，酶活達到40.1 U/mL，裝液量40 mL和50 mL時酶活相差不大，在實驗中為了提高效率，可以選用50 mL的裝液量。

2.3.3不同的發酵溫度對產酶的影響

研究不同溫度（28、32、37、40℃）采用產酶發酵培養基配方其它發酵條件不變，對β-葡萄糖苷酶活力的影響，結果見圖4。

2.3.4不同的轉速對產酶的影響

圖4　不同培養溫度對β-葡萄糖苷酶活力的影響Fig.4Effect of different cultivation temperature on the activity of β-glucosidase

研究不同轉速（70、120、150、180 r/min）采用產酶發酵培養基配方，其它發酵條件不變，對β-葡萄糖苷酶活力的影響，結果見圖5。

圖5　不同轉速對β-葡萄糖苷酶活力的影響Fig.5Effect of different rotation speed on the activity of β-glucosidase

由圖5可知，轉速為160 r/min時，菌株的產酶最高，為39.5 U/mL。納豆菌為兼性好氧芽孢桿菌，由此可見，增大溶氧量對菌體產酶也有很大影響。

2.3.5發酵時間對產酶的影響

研究不同發酵時間（24、32、48、60、72 h）采用產酶發酵培養基配方，其它發酵條件不變，對β-葡萄糖苷酶活力的影響，結果見圖6。

圖6　不同發酵時間對β-葡萄糖苷酶活力的影響Fig.6Effect of different fermentation hours on the activity of β-glucosidase

由圖6可知，發酵時間為60 h時，菌株產酶最高，為49.6 U/mL。

2.4正交試驗結果與分析

通過一系列產酶條件優化，得出NattoA-3的單因素產酶條件，分別是pH為7.3，裝液量為50mL/250mL，培養溫度為34℃，轉速160 r/min，發酵56 h。通過觀察發現，轉速和發酵時間與其他條件相比對產酶的影響稍顯平穩，其他條件的變化反差較大基本可以確定。另外，豆粕的添加量也是影響染料木素產率的重要因素。為了最大限度使產率提高，本實驗采取三因素三水平L9（33）正交試驗確定最佳工藝條件。因素水平表見表2，結果分析表見表3。

表2　因素水平表Table 2Factor Level

表3　結果分析表Table 3Result Analysis

從表3結果分析表明，影響實驗結果的主次順序分別為C＞A＞B，最佳優化組合為A1B3C3，即8%豆粕添加量，180 r/min，培養64 h。從總體趨勢來看，培養時間對染料木素的產率影響最大，在豆粕添加量相同的情況下，發酵時間越長，產率越高。

3討論

通過單因素和正交試驗確定，得出納豆芽孢桿菌A-3發酵豆粕產染料木素的最佳條件為8%豆粕添加量，培養溫度為34℃，轉速為180 r/min，培養64 h，pH為7.3，裝液量為50 mL/250 mL，接菌量為10%通過穩定性試驗，目的產物染料木素的產率為0.12%，轉化率為89.13%，達到理想水平。發酵法生產的大豆染料木素產品對異黃酮中的染料木苷等糖苷形式進行轉化，提高了染料木素的含量，對大豆豆粕進行后續的加工延長整個產業鏈的關鍵環節，而且對大豆行業的發展起到了極其重要的促進作用，產業化前景十分良好。

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Study on the Soybean Genistein by Fermentation Method

LI Jing，ZHANG Shu-liang，ZHAO Dong-mei
（Product Quality Supervision and Inspection Institute of Hongqiao District，Tianjin 300122，China）

The optimal conditions of producing genistein demonstrated by applying sigle factor and response surface methodology were that the concentration of soybean meal，rotation speed，fermentation hours the optimal pH were 8%，180 r/min，64 h，7.3，the liquid loading amount was 50 mL/250 mL，the bacteria amount was 10%.The yield of genistein ratio arrived at 0.12%，the conversion rate was 89.13%，which achieves the optimal level.

defatted soybean meal；fermentation genistein；fermentation conditions

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.14.019

2015-05-15

李晶（1969—），女（漢），工程師，本科，研究方向：食品檢驗技術。