解淀粉芽孢桿菌LJ1搖瓶發酵條件優化

李娟 夏凱麗 王遠宏 董蘊琪 郝蕾

（天津農學院，天津 300384）

解淀粉芽孢桿菌LJ1搖瓶發酵條件優化

李娟 夏凱麗 王遠宏 董蘊琪 郝蕾

（天津農學院，天津 300384）

解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）LJ1是從天津土壤中分離篩選出的一株具有廣譜抑菌效果的生防菌株，該實驗旨在明確B. amyloliquefaciens LJ1的抑菌譜并通過優化發酵培養基和發酵條件提升其抑菌效果。通過對峙培養檢測菌株LJ1對14種病原真菌的抑制效果；采用單因素試驗、正交試驗優化發酵培養基和搖瓶發酵條件；最后用孢子萌發法和盆栽試驗驗證優化后發酵液的抑菌效果。實驗結果表明B. amyloliquefaciens LJ1對黃瓜灰霉病菌（Botrytis cinerea）、蘋果炭疽病菌（Glomerella cingulata）、蘋果腐爛病菌（Valsa ceratosperma）等11種病原真菌有抑制作用；優化后的搖瓶發酵條件為溫度30℃、初始pH 5、轉速200 r/min、裝液量50 mL/250 mL；優化后的發酵培養基為馬鈴薯 200 g，蔗糖10 g，黃豆粉20 g，MgCl2·6H2O 1.5 g，蒸餾水1 000 mL。經發酵條件與培養基優化后，B. amyloliquefaciens LJ1發酵液對Botrytis cinerea孢子萌發的抑制率達99.7%，盆栽實驗防效達51.08%。

解淀粉芽孢桿菌LJ1；抑菌譜；發酵條件優化

微生物農藥在四大種類生物農藥中占有舉足輕重的地位［1］。芽孢桿菌由于抗逆性高、作用機制復雜、功能明顯等因素已作為微生物農藥在農業領域廣泛應用。解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）是芽孢桿菌的一個種，也是重要的防治植物病害的微生物資源［2-4］。解淀粉芽孢桿菌能夠分泌多種依賴NRPs（Nonribosomal peptide synthetase，NRPs）和PKS（Polyketide synthetase，PKS） 以 及NRPS/PKS代謝途徑組合的次生代謝抑菌物質［5-8］，并協同其他機制如誘導抗病性［9］、促進生長［10］和提高植物營養吸收率［11］等因素保障植物的健康。優化發酵條件，增加生物活性物質的含量和微生物的生物量是提高生防制劑應用效果的的重要前提，與此相關的與解淀粉芽孢桿菌的研究已有報道［12-14］。

解淀粉芽孢桿菌B. amyloliquefaciens LJ1是從土壤中分離獲得的一株生防菌株，它與環境相容性好，對生物安全，大田試驗表明LJ1發酵液對瓜類白粉病有很好的防治效果并可以誘導黃瓜產生抗病性［15，16］。本實驗探索解淀粉芽孢桿菌LJ1的抑菌譜和對黃瓜灰霉病防治能力，并對其搖瓶發酵條件和培養基進行初步優化，以期提高其抑菌能力和防病效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）LJ1由天津農學院植物病理實驗室從土壤中分離，篩選，保存。指示菌：黃瓜灰霉病菌（Botrytis cinerea）、蘋果炭疽病菌（Glomerella cingulata）、小麥赤霉病菌（Gibberrella zeae）、栆輪紋病菌（Macrophoma kuwastsukaii）、板栗炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、蘋果腐爛病菌（Valsa ceratosperma）、稻瘟病菌（Phyricularia grisea）、辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）、蘋果青霉病菌（Penicillium expansum）、棗黑點病菌（Coniothyrium fucsidulum）、層出鐮刀菌（Fusarium proliferatum）、高粱炭疽病菌（Colletotrichum graminicola）、小麥紋枯病菌（Rhizoctonia cerealis）、小麥全蝕病菌（Gaeumanomyces graminis）由天津農學院植物病理實驗室提供。

1.1.2 主要培養基 PDA：馬鈴薯200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂粉 16 g，蒸餾水 1 000 mL。LB培養基：Yeast extract 5 g，Tryptone 10 g，氯化鈉 10 g，瓊脂粉 16 g，蒸餾水 1 000 mL。種子培養基：Yeast extract 5 g，Tryptone 10 g，氯化鈉 10 g，蒸餾水 1 000 mL。無碳培養基：（NH4）2SO42.0 g，NaH2PO4·H2O 0.5 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl2·2H2O 0.1 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 6.5。無氮培養基：葡萄糖 10 g，KH2PO41.36 g，Na2HPO42.13 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，FeSO4·7H2O 0.000 5 g，CaCl20.005 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.0-7.2。

1.2 方法

1.2.1 解淀粉芽孢桿菌LJ1平板抑菌效果的測定 采用管碟法［17］稍加改進來檢測解淀粉芽孢桿菌LJ1對上述14種病原真菌的抑菌效果。取25℃培養5 d的指示菌，取4 cm2的菌塊加入3 mL無菌水沖洗，制成菌絲懸浮液，取1 mL菌絲懸浮液加入30-50℃的PDA培養基中迅速搖勻，倒入培養皿中（厚度為3 mm），待凝固后將牛津杯置于培養基中央，加入200 μL在PDA液體培養基中28℃，200 r/min培養16 h的LJ1發酵液。將平板置于27℃下培養3 d后，觀察并測量抑菌圈的直徑。

1.2.2 解淀粉芽孢桿菌LJ1生長曲線的測定 種子液的制備：將解淀粉芽孢桿菌LJ1在LB培養基上劃線培養，挑取單菌落接種在種子培養基中，28℃，200 r/min振蕩培養16 h。取48支含5 mL種子培養基的試管，接10 μL種子液加入試管中，于28℃，200 r/min振蕩培養，每隔2 h用種子培養基接LJ1菌株，置于搖床中，28℃ 200 r/min搖菌。每隔2 h測定培養液吸光值，每個處理重復3次。以OD600值為縱坐標，以培養時間為橫坐標，繪制LJ1菌株的生長曲線。

1.2.3 搖瓶發酵條件優化 以初始pH值、溫度、轉速、裝液量為試驗因素，按照正交設計表L9（34）設計4個因素、3個水平（表1）的正交試驗來優化B. amyloliquefaciens LJ1的搖瓶發酵條件。

表1 發酵條件正交試驗設計

在PDA液體培養基中加入1%的種子液，根據正交實驗表各處理不同發酵條件搖菌26 h。各組發酵液稀釋100倍后采用載玻片孢子萌發法測定對B.cinerea孢子萌發的抑制效果。

萌發率=孢子萌發數/孢子總數×100%

LJ1發酵液抑菌率=（對照萌發率-處理萌發率）/對照萌發率×100%

1.2.4 解淀粉芽孢桿菌LJ1培養基的優化

1.2.4.1 解淀粉芽孢桿菌LJ1培養基碳源的選擇 參考谷醫林的研究［18］，在無碳培養基中分別添加10 g/L的可利用碳源，28℃，200 r/min搖菌26 h。分別用分光光度計檢測600 nm下的OD值，篩選出有利于LJ1菌株生長的幾種碳源。將篩選出的碳源加入無碳培養基中，終濃度分別為10 g/L、20 g/L、50 g/L。加入1%種子液，28℃，200 r/min搖菌26 h，每處理重復3次，用活菌計數法［19］測定培養基中菌量，進而篩選出最佳碳源及其最適濃度。

1.2.4.2 解淀粉芽孢桿菌LJ1氮源的選擇 在無氮培養基中分別加入終濃度為5 g/L的牛肉浸膏、酵母膏、草酸銨、乙酸銨、硝酸鉀、尿素、硫酸銨、亞硝酸鈉、鉬酸銨、氯化銨、磷酸二氫銨、黃豆粉、硝酸鈣等氮源，28℃，200 r/min搖菌26 h。用分光光度計檢測OD600值和轉接劃線的方法來測定LJ1可利用氮源，并選取有利于菌株LJ1生長的氮源，進一步篩選。將初步篩選出的氮源加入無氮培養基中，終濃度分別為5 g/L、10 g/L、20 g/L。加入1%種子液，28℃，200 r/min搖菌26 h，每處理重復3次，用活菌計數法測定培養基中菌量，篩選出最佳氮源及其最佳濃度。

1.2.4.3 解淀粉芽孢桿菌LJ1無機鹽的選擇 將MnSO4·H2O、MgCl2·6H2O、ZnSO4·7H2O、FeC6H5O7、FeCl3、CuSO4·5H2O加入PDA液體培養基中終濃度分別為0. 5 g/L、1 g/L、1.5 g/L。以PDA液體培養基為對照，加入1%種子液，28℃，200 r/min搖菌26 h，每處理重復3次，用活菌計數法測定培養基中菌量，篩選出最佳金屬離子及其的最佳濃度。

1.2.5 發酵條件優化驗證 用孢子萌發法和盆栽試驗法來驗證培養基和條件優化后的發酵液抑菌效果。將種子液以1%接種量分別接種到PDA液體培養基和優化后的培養基中。PDA液體培養基發酵條件：28℃，200 r/min，初始pH 7.0 裝液量100 mL，優化培養基采用優化后的發酵條件，采用孢子萌發法測定發酵液對B. cinerea孢子萌發的抑制效果。

盆栽實驗：將優化前、后發酵液稀釋100倍后噴施于三葉期黃瓜幼苗上，每個處理重復6盆，每盆3株黃瓜苗，以無菌水噴灑為對照。24 h后，將1×105CFU/mL的黃瓜灰霉病菌孢子懸浮液均勻噴灑在黃瓜苗葉片上。于20℃，保濕，溫室密閉培養，7 d后觀察黃瓜苗發病情況，統計病情指數并計算發酵液防治效果，病情分級參考曹春娜等的方法［20］。

病情指數=∑［（各級病葉數×代表級值）］（/調查總葉數×最高代表級值）×100

防治效果（%）=（對照發病指數-處理發病指數）/對照發病指數×100

2 結果

2.1 解淀粉芽孢桿菌LJ1平板抑菌效果

將LJ1與14種病原真菌做平板對峙培養，結果表明解淀粉芽孢桿菌LJ1與高粱炭疽病菌（C. graminicola）、小麥紋枯病菌（R. cerealis）、小麥全蝕病菌（G. graminis）對峙培養無抑菌圈產生，對黃瓜灰霉病菌（B. cinerea），蘋果炭疽病菌（G. cingulata）、棗輪紋病菌（M. kuwastsukaii）等11種病原菌均產生明顯抑菌圈，其中對黃瓜灰霉病菌的抑制效果最高，抑菌圈直徑達15.73 mm。對峙培養結果顯示B. amyloliquefaciens LJ1具有廣譜抑菌效果，有較好的應用潛力。

表2 B. amyloliquefaciens LJ1和植物病原真菌的對峙培養

2.2 解淀粉芽孢桿菌LJ1生長曲線

生長曲線反映了細菌培養過程中的生長和繁殖規律。細菌的生長一般要經過延滯期、對數期、穩定期、死亡期4個時期，LJ1的生長曲線如圖1所示為S型生長曲線。在0-6 h LJ1菌量處在延滯期，LJ1菌株繁殖較少，為細菌的分裂增殖儲存充足的酶、能量及中間代謝產物。6-14 h細菌LJ1處于對數增長期，OD值快速上升。14-26 h細菌LJ1處于穩定期，群體生長停止，生長曲線趨于平穩。實驗中檢測B. amyloliquefaciens LJ1的活菌數和抑菌效果均在穩定期進行檢測。26 h后進入死亡期，細菌繁殖速度減慢逐漸死亡。

圖1 B. amyloliquefaciens LJ1的生長曲線

2.3 搖瓶發酵條件優化

正交實驗不同發酵條件培養的B. amyloliquefaciens LJ1發酵液對B. cinerea孢子萌發的抑制效果如表3所示，表4為正交實驗各因素不同水平的評價。由表4可以看出不同pH值、溫度、轉速、裝液量培養的LJ1發酵液對B. cinerea孢子萌發的抑制效果不同。由極差R值的大小比較說明對LJ1菌株發酵液抑菌能力的影響順序為裝液量＞ pH值＞溫度＞轉速。其中，裝液量和pH值對發酵液的抑菌效果影響較大。裝液量50 mL，pH值5，溫度30℃均顯著好于其他水平。轉速200 r/min與150 r/min無顯著差異，但顯著好于100 r/min。綜合考慮仍選擇200 r/min為最優轉速。因此，B. amyloliquefaciens LJ1發酵條件最優組合為裝液量50 mL，pH值5，溫度30℃，轉速200 r/min。

表3 正交實驗優化B. amyloliquefaciens發酵條件［L9（34）］

表4 發酵條件的多重比較

2.4 解淀粉芽孢桿菌LJI培養基的優化

2.4.1 C源對解淀粉芽孢桿菌LJ1的影響 以16種解淀粉芽孢桿菌LJ1可以利用碳源為單一碳源搖菌培養。以脯氨酸、葡萄糖、蔗糖為碳源的培養基搖菌后B. amyloliquefaciens LJ1生長狀態最好，培養基渾濁度較高。在無碳培養基中分別加入10 g/L、20 g/L、50 g/L的脯氨酸、葡萄糖、蔗糖，28℃，200 r/min搖菌26 h 后，檢測B. amyloliquefaciensLJ1菌量，結果如圖2所示，不同碳源對LJ1菌量的影響不同。在無碳培養基中加入相應碳源后，碳源對菌量的影響由大到小依次為：蔗糖＞葡萄糖＞脯氨酸，當加入10 g/L蔗糖時菌量達到最大，為9.08×108CFU/mL。由圖2可知各碳源最適濃度均為10 g/L，加入過量碳源不利于LJ1的生長。因此，選擇10 g/L的蔗糖為最佳碳源。

2.4.2 氮源對解淀粉芽孢桿菌LJ1的影響 將各氮源加入無氮培養基中，結果顯示B. amyloliquefaciens LJ1可利用氯化銨、牛肉浸膏、酵母膏、草酸銨、乙酸銨、尿素、硫酸銨、磷酸二氫銨、硝酸鈣、黃豆粉為唯一氮源；不可利用鉬酸銨、亞硝酸鈉、硝酸鉀。其中以黃豆粉、酵母膏和硝酸鈣為氮源時B. amyloliquefaciens LJ1生長狀態最好，培養基渾濁度較高。

圖2 碳源對菌株LJ1生長量大小的影響

所篩選的氮源就LJ1生長量而言，都有一個較為適合的濃度（圖3），硝酸鈣適宜濃度為5 g/L，酵母膏適宜濃度為10 g/L，黃豆粉適宜濃度為20 g/L。比較而言，以有機氮源對LJ1的生長較為有利，尤其黃豆粉最為明顯，其最大生長量達到1.59×108CFU/mL，分別為前兩者最大生長量的2.02倍和2.56倍。同為有機氮源，黃豆粉較酵母膏更適宜LJ1的生長，可能由于黃豆粉富含速效氮源和遲效氮源，以及碳水化合物和微量元素，更適宜細菌快速繁殖。因此，選擇20 g/L的黃豆粉為最佳氮源。

圖3 氮源對菌株LJ1生長量大小的影響

2.4.3 無機鹽對解淀粉芽孢桿菌LJ1的影響 在PDA液體培養基中加入無機鹽，搖菌后檢測其菌量。結果（圖4）表明培養基中加入CuSO4·5H2O后菌株LJ1在培養基中生長極慢，說明Cu2+對解淀粉芽孢桿菌LJ1的生長有抑制作用，這與Cu2+使細菌蛋白變性有關。如圖4所示，MnSO4·H2O、MgCl2·6H2O、ZnSO4·7H2O、FeC6H5O7、FeCl3均能促進LJ1菌量的增長，且MgCl2·6H2O ＞MnSO4·H2O ＞ ZnSO4·7H2O ＞ FeC6H5O7＞FeCl3。研究中發現，當MgCl2·6H2O達到1.5 g/L時，其菌量較加入0.5 g/L和1.0 g/L有明顯的躍升，為2.403× 1010CFU/mL。這一現象與鎂離子參與細菌細胞質的合成，尤其對革蘭氏陽性菌的生長繁殖影響較大有關［21］。因此，研究中選擇1.5 g/L MgCl2·6H2O作為適宜濃度。

圖4 無機鹽對LJ1生長量（107）的影響

2.5 優化驗證實驗結果

PDA液體培養基（優化前）為：馬鈴薯200 g，葡萄糖 20 g，蒸餾水 1 000 mL，初始pH7.0，28℃，200 r/min，裝液量100 mL/250 mL。

優化后為：馬鈴薯 200 g，蔗糖 10 g，黃豆粉20 g，MgCl2·6H2O 1.5 g，初始pH 5.0，30℃，200 r/min，裝液量50 mL/250 mL。如表5所示，經過優化B. amyloliquefaciens LJ1搖瓶發酵培養基成分和發酵條件后，發酵液對B. cinerea的抑制和防治效果都得到了顯著提高。LJ1發酵液對B. cinerea孢子萌發的抑菌率從65.0%提高至99.7%；溫室條件下對黃瓜灰霉病發生的防治效果從30.98%提高到51.08%。

3 討論

B. amyloliquefaciens LJ1對 B. cinerea、G. cingul-ata、G. zeae、M. kuwastsukaii等11種病原真菌均有較好的抑菌效果。優化解淀粉芽孢桿菌發酵培養液及發酵條件不僅可以提高菌體的生長速度，還可以有效地提高抗菌活性物質的產量及防效［22-24］。對B. amyloliquefaciens LJ1發酵條件的研究表明，溫度30℃、初始pH 5、轉速200 r/min、裝液量50 mL時，LJ1發酵液抑菌活性達到最高。其中，裝液量和pH值對發酵液的抑菌效果影響較大。裝液量與抑菌效果呈負相關，轉速與抑菌效果呈正相關，說明解淀粉芽孢桿菌LJ1為好氧型細菌。這一結果暗示LJ1所產抑菌物質多少和菌體數量有相關性，通過提高溶解氧可以加速LJ1的生長，提高LJ1細胞生長量，從而縮短其進入次生代謝的時間，加快、加大次生代謝抑菌物質的產生。pH值主要通過影響菌體細胞膜滲透性及營養物質離子化程度來影響菌體對養分的吸收。實驗發現LJ1菌株在初始pH 4的培養基中無法生長，而初始pH 5時效果最好，說明B. amyloliquefaciens LJ1適宜在偏酸性的環境中生長，過酸過堿均不利于它的生長，與Zhao等［25］的研究一致。

表5 發酵液對黃瓜灰霉的抑制與防效分析

細菌菌體發酵過程中，延滯期和對數期主要進行菌體的繁殖，菌量大量增加，進入穩定期后菌量基本保持穩定，細菌次級代謝產物積累，常常在這個時期進行次級代謝產物的生產和檢測。B. amyloliquefaciens LJ1在14-26 h處于穩定期，在26 h時菌量保持較高但略有下降，此時次生代謝物質較多，因此選擇發酵26 h時進行抑菌能力檢測。在不同培養條件下，菌量是次生代謝物質產生多少的一個重要前提條件［26］，這與上述結果與分析相一致。研究中也發現，一些礦物質元素能提高發酵產物產量，尤以Mg2+最為明顯，這和Mg2+是一些功能蛋白的重要輔酶因子有關，Mg2+可以提高其催化活性，加快代謝進程，提高抑菌活性［27］。

碳氮比是微生物發酵培養中關鍵的參數，它反映了培養基中碳、氮營養物質的濃度和兩者的比率。眾多研究發現，適宜的碳氮比是提高發酵活性物質含量和生物量的重要條件［28-30］。本研究中，氮源對生物量變化的影響尤其明顯，分析認為主要是因為受到碳氮比率的影響所致。此外，由于培養基中沒有目的性加入緩沖物質，不適宜的碳氮比也可能通過影響動態發酵過程中pH值來影響發酵生物量。

4 結論

解淀粉芽孢桿菌LJ1有廣譜的抑菌效果。優化后發酵條件為30℃、初始pH 5、轉速200 r/min、裝液量50 mL/250 mL，裝液量和pH值對發酵液的抑菌效果影響較大。優化后的培養基成分為：馬鈴薯200 g，蔗糖 10 g，黃豆粉20 g，MgCl2·6H2O 1.5 g，蒸餾水 1 000 mL。在優化條件下B. amyloliquefaciens LJ1發酵液對B. cinerea孢子萌發的抑制率從65.0%提高至99.7%；溫室條件下對黃瓜灰霉病的防治效果從30.98%提高到51.08%。

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（責任編輯李楠）

The Optimization of Fermentation Condition in Flask for Bacillus amyloliquefaciens LJ1

Li Juan Xia Kaili Wang Yuanhong Dong Yunqi Hao Lei
（Tianjin Agriculture University，Tianjin 300384）

Bacillus amyloliquefaciens strain LJ1 isolated from the soil of Tianjin is biocontrol one with broad inhibition spectrum. This study aims to clarify the inhibition spectrum of strain B. amyloliquefaciens LJ1 and improve the antifungal activity by optimizing the medium composition and fermentation conditions. The confront culture was performed to test the antifungal activity of LJ1 on 14 phytopathogenic fungi. The medium composition and fermentation conditions were optimized by single-factor and orthogonal experiments. Finally， the inhibitory effect of optimized broth was tested by methods of spore germination and pot experiment. The results showed that B. amyloliquefaciens LJ1 inhibited 11 tested fungal pathogens， i. e. ， Botrytis cinerea， Glomerella cingulata， and Valsa ceratosperma. The optimal fermentation conditions were as temperature 30℃， initial pH5.0， rotation speed 200 r/min， and medium volume 50 mL/250 mL. The optimal composition of the medium was 200 g potato， 10 g sucrose， 20 g soybean flour， 1.5 g MgCl2·6H2O， and 1 000 mL distilled water. In conclusion， the inhibition rate of B. amyloliquefaciens LJ1 to the conidia germination of B. cinerea reached 99.7%， and the control efficacy of pot experiment was 51.08% under the optimum fermentation medium and culture conditions.

Bacillus amyloliquefaciens LJ1；inhibition spectrum；optimization of fermentation condition

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.031

2015-04-01

國家自然科學基金項目（31171892），國家大學生創新項目（201410061107）

李娟，女，碩士研究生，研究方向：果樹病蟲害綜合治理；E-mail：jie_5101@163.com；夏凱麗為并列第一作者

王遠宏，男，博士，教授，研究方向：生物農藥及合成生物學；E-mail：wangyh@tjau.edu.cn