不同溫度培養下釀酒酵母細胞壁蛋白質差異分析

谷月樸永哲，2杜維王小瑜王春艷

（1.大連工業大學生物工程學院，大連 116034；2.大連民族大學生命科學學院，大連 116600）

不同溫度培養下釀酒酵母細胞壁蛋白質差異分析

谷月1樸永哲1，2杜維1王小瑜1王春艷1

（1.大連工業大學生物工程學院，大連 116034；2.大連民族大學生命科學學院，大連 116600）

生物體在其生長過程中要經受一系列非生物環境的脅迫，這些脅迫條件都將影響細胞的基因轉錄、蛋白質表達物等一系列的變化，以盡快適應周圍變化的環境。利用雙向電泳和質譜技術考察了高溫脅迫對釀酒酵母細胞壁蛋白質組的影響。結果表明，高溫脅迫的釀酒酵母FFC2146細胞壁蛋白質中新增Ssa2和小分子鳥苷三磷酸酶，無機焦磷酸酶上調表達，而丙酮酸激酶缺消失，同時6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶和3-磷酸甘油醛脫氫酶下調表達。上述結果說明熱休克蛋白Ssa2保護細胞壁在高溫下保持完整，使細胞繼續生長繁殖；高溫脅迫下釀酒酵母的糖酵解途徑受阻，在轉酮醇酶的作用下糖酵解途徑轉向磷酸戊糖途徑途徑，獲取足夠的能量，維持細胞正常的新陳代謝。

釀酒酵母；雙向電泳；熱激蛋白

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一類被廣泛應用的生產菌株，同時也是真核模式生物。它的非病原性以及用于生產消費性產品（乙醇、面包等）的長久歷史激發了人們對該微生物的研究興趣，同時它是公認安全（generally regarded as safe，GRAS）的微生物。Saccharomyces cerevisiae發酵的最適溫度在28-33℃，一般不超過36℃。在發酵過程中，高溫會使蛋白變性，也會引起質膜流動性的變化，如高溫使磷脂分子在膜內作快速的側向擴散，使膜脂的流動性增加，破壞膜的完整性，從而導致細胞的存活力迅速下降［1-3］。

自從 1962 年 Ritossa 首次在果蠅中發現熱激現象（Heat shock）后，便成為研究酵母耐熱機制的一個重要領域。陸續有研究發現釀酒酵母經不同程度的熱激后會產生不同種類熱激蛋白（Heat shock proteins，HSP），酵母耐熱機制的研究則主要以熱激蛋白及生物耐熱性為中心。由于酵母的耐熱機制非常復雜，其研究方法也從經典的遺傳學方法過渡到了分子生物學技術。最近幾年，已知的參與熱耐受的分子有熱激蛋白［4］、海藻糖［5］、應激糖蛋白、膜結合 ATP 酶等，這些因素都在酵母耐熱機制中扮演著重要角色。

Saccharomyces cerevisiae在發酵過程中要經受一系列的環境脅迫，如高溫、高糖以及不斷積累的乙醇，所有的這些脅迫條件都會影響細胞的生長速率和活性。當細胞經受這些脅迫時，復雜的生物代謝網絡中會發生一系列動態的變化：包括基因、蛋白和代謝物等的變化［6］，以盡快的適應周圍變化的環境。

Saccharomyces cerevisiae的碳代謝途徑主要為糖酵解（EMP）途徑和戊糖磷酸（HMP）途徑，與之相關的酶系分布在線粒體、內質網、液泡、細胞質膜及細胞壁上，其代謝調節及其復雜。研究表明與糖酵解有關的果糖-1，6-二磷酸激酶（Fructose-1，6-bisphosphatase），蘋果酸脫氫酶（Malate Dehydrogenase）等酶在細胞壁中發揮作用［7］。鑒于此本研究利用蛋白質組學技術考察高溫對Saccharomyces cerevisiae細胞壁蛋白質的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗菌種：Saccharomlyces cerevisiae FFC2146，由大連工業大學菌種保藏所提供。培養基：YPD培養基（1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖）。實驗所用試劑：Chaps，IAM，DTT，IPG兩性電解質來自Sigma公司；ASB-14為CALBIOCHEM公司；過硫酸銨，尿素為優級純；其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 馴化培養 從保藏的斜面上接取Saccharomlyces cerevisiae FFC2146至20 mL培養基中好氧條件過夜培養，經過兩次活化制成種子液。按2%接種量接入YPD培養基，分別在28℃和37℃下160 r/min馴化培養，每隔24 h，取1 mL菌液稀釋測600 nm處的吸光值，至28℃和37℃兩溫度的吸光度值基本一致，即生長速度基本相同為止。

1.2.2 釀酒酵母培養 馴化培養后的菌株在對數期按2%接種量接入100 mL培養基中，培養條件為160 r/min，28℃和37℃。做出釀酒酵母正常生長溫度28℃和對照溫度37℃時的生長曲線。

1.2.3 酵母細胞掃描電鏡觀察 活化單菌落，接種1 mL種子液培養至穩定期，分別于28℃和37℃下以160 r/min進行24 h的振蕩培養后10 000×g 離心10 min收集細胞。離心后的菌體用超純水洗滌兩次，再次離心得酵母菌體，烘干、制片后用掃描電鏡觀察。

1.2.4 胞壁結合蛋白的提取 采用DTT抽提結合苯酚萃取法［8］。取28℃第15代與37℃第15代20 h發酵液于4℃，10 000×g離心，收集細胞沉淀。用50 mmol/L Tris-HCl緩沖液清洗3次。用含有DTT，PMSF的上述緩沖液于冰浴中振蕩2 h后離心收集上清。上清液中加入等體積的Tris-平衡酚（pH8.0）冰浴振蕩萃取1 h后離心收集酚相與中間層。該液體加入3倍體積的預冷的乙酸銨/甲醇溶液，于-20℃冰箱中靜置過夜。第2天離心后，用含有DTT的丙酮清洗2次，再用冷丙酮清洗1次，凍干得到蛋白干粉。

1.2.5 雙向電泳技術 雙向電泳的操作在季楊楊［9］的方法上進行了改進。分裝蛋白：將得到的蛋白干粉用適量的蛋白裂解液（8 mol/L尿素、3 mol/L硫脲、50 mmol/L DTT、2% ASB-14、4% IPG buffer pH 3-10）溶解，用Bradford［10］方法測定蛋白質含量，每管100 μg分裝。

雙向電泳：將0.64 g尿素、560 μL雙蒸水、250 μL 30%丙烯酰胺溶液混勻超聲除氣3 min，加入24 μL IPG buffer pH4-6、12 μL IPG buffer pH3-10混勻超聲除氣3 min，再加入4 μL10%過硫酸銨溶液、5 μL TEMED溶液，用1 mL槍反復吸打混勻，緩慢注入膠管中，室溫聚合45 min后使用。陰極緩沖液為30 mmol/L NaOH溶液，陽極緩沖液采用10 mmol/L H3PO4溶液，陰極上樣，以300 V 35 min，700 V 1 h，1 600 V 4 h進行第一向等電聚焦。

等電聚焦結束后，將膠條擠出進行兩次膠條平衡，每次15 min。平衡液1（擠出平衡液加0.4%DTT 200 μL），平衡液2（基礎平衡液加1%碘乙酰胺500 μL）。平衡結束后，進行第二向SDS-PAGE電泳，將平衡好的膠條放置在提前制好的15%的分離膠上，在轉移膠條的過程中要盡量避免產生氣泡。電泳條件為20 mA 20 min，50 mA電流至電泳結束。二維電泳結束后，將凝膠固定過夜，次日用考馬斯亮藍染色液染色，直至凝膠上蛋白點清晰可見。染色后的凝膠用掃描儀照相，利用PDquest8.0軟件對蛋白點進行差異性分析。

1.2.6 質譜分析

1.2.6.1 前期酶解 用去尖的槍頭從膠上切下蛋白點后清洗，加入50%乙腈/0.2 mol NH4HCO3（pH8.0）進行脫色，用100%ACN進行脫水，凍干后的膠加入胰蛋白酶溶液進行酶解。

1.2.6.2 質譜樣品制備 向吸漲后的膠塊加入不含胰蛋白酶的50 mmol NH4HCO3緩沖液，放置在37℃培養箱反應過夜。離心后，取出上清轉移至加入了60%CH3CN/5 %TFA的新管中；在沉淀中加入超純水，孵化10 min，離心移出上清與前一管上清液混合；再向沉淀中加入60% ACN/0.1%TFA超聲15 min，吸出溶液并入前次上清，反復抽提2次，將所得上清用真空離心濃縮儀干燥5 min，放入-80℃冰箱中過夜。次日凍干后-80℃保存。

1.2.6.3 質譜分析 利用Q Exactive質譜進行鑒定。色譜條件：富集柱：C18（100 μm×2 cm），分析柱C18（75 μm×15 cm，2 μm），流動相a：98%H2O+ 2%CH3CN+0.1%TFA， 流 動 相b：20%H2O+80% CH3CN+0.1%TFA，柱溫35℃，流速0.25 μL/min。質譜條件：噴霧電壓2.5 kV，離子源溫度300℃，掃描范圍：m/z=300-2 000。然后利用Xcalibue軟件和NCBI等相關數據庫搜索比對，再利用KEGG將鑒定出的蛋白進行代謝流分析。

2 結果

2.1 馴化結果

傳統釀酒酵母的最適溫度在 28-33℃，一般不超過 36℃，40℃以上將嚴重抑制菌體生長［1］。首先對Saccharomlyces cerevisiae FFC2146進行了耐溫馴化。由圖1可知，Saccharomlyces cerevisiae FFC2146在37℃馴化前期其生長速度明顯低于28℃的，但隨著馴化時間的延長（第15代），兩個培養溫度下菌體生長速度基本一致。將馴化的菌株作為種子液，分別在28℃和37℃下進行培養，兩者均在20 h達到最大生長量，且菌體濃度相近（圖2）；掃描電鏡分析表明，經過馴化培養的釀酒酵母菌株在28℃與37℃下外觀形態無明顯變化，細胞完整（圖3），說明Saccharomlyces cerevisiae FFC2146經馴化后細胞生長及形態依然保持良好的狀態。

圖1 釀酒酵母FFC2146耐熱馴化結果

圖2 釀酒酵母FFC2146生長曲線

圖3 28℃（A）和37℃（B）FFC2146釀酒酵母的掃描電子顯微鏡圖

2.2 雙向電泳圖譜結果

圖4為在28℃與37℃培養溫度下釀酒酵母細胞壁蛋白質的雙向電泳圖譜。利用PDquest軟件進行檢測，分別檢測到539個蛋白斑點和540個蛋白點，兩者胞壁蛋白質大多聚集在pH4-6的區域，分子量分布在30-90 kD之間。由于細胞壁蛋白的糖基化造成分子量不均，因此在圖譜上可見較為清晰的橫向拖尾，但圖譜的重復率（97.1%）比較好，靈敏度比較高，不影響圖譜的進一步分析。當外界環境改變時，生物體合成一系列響應蛋白，以適應環境變化，釀酒酵母在37℃培養時，新增2個（No.6、7）；消失1個（No.1）；上調2個（No.2、3）；下調2個（No.4、5），可見在不同溫度下胞壁蛋白的數量和表達量沒有明顯變化。

圖4 正常生長溫度28℃（A）與高溫37℃（B）條件下的釀酒酵母FFC2146胞壁蛋白雙向電泳圖

2.3 質譜結果

根據上述雙向電泳圖譜分析的結果，選取1-7號蛋白質斑點進行了質譜鑒定，結果如表1所示。

3 討論

3.1 熱休克蛋白Ssa2保護細胞壁

大多數生物體在受到高溫刺激時，首先會合成進化上高度保守的熱休克蛋白（Heat shock proteins），關閉某些正常的代謝途徑保護自身的同時開啟另一代謝途徑，以保護細胞繼續生長繁殖。當細胞受到脅迫時，細胞內熱休克蛋白HSP70與熱激蛋白轉錄因子（Heat shock factor 1，HSF1）分離，HSF1迅速識別并結合至熱激元件（Heat shock element，HSE，5'-NGAAN-3'）［11］啟動分子伴侶的轉錄，分子伴侶結合至未折疊的蛋白質，阻止折疊錯誤的發生。HSP70等熱休克蛋白結合至鋅指轉錄因子（MSN2/MSN4），MSN2/MSN4調控多個代謝脅迫應答有關的基因，防止細胞內的蛋白質受到高溫影響時產生沉淀，減少由蛋白酶體和溶酶體造成的不穩定蛋白的水解降解［12］，從而使環境的不利影響降到最低限度［13］。然而熱脅迫首先會影響細胞壁及細胞膜的結構與功能，質譜鑒定結果表明Saccharomlyces cerevisiae FFC2146受到熱脅迫后胞壁中出現了Ssa2蛋白。Ssa2屬于熱休克蛋白70家族，在正常生長環境中，調控基因Ssa2的表達處于休眠水平，Saccharomlyces cerevisiae FFC2146細胞壁中起到“管家”功能［14］。Saccharomlyces cerevisiae FFC2146新增的Ssa2蛋白不僅幫助保護細胞免受應激力的不利影響［15］，還參與真菌細胞壁的生物合成和蛋白質的跨膜轉運，使酵母細胞在高溫下保持完整細胞形態及細胞膜的轉運功能。

3.2 無機焦磷酸酶調節糖酵解途徑流向

在釀酒酵母中，無機焦磷酸酶（Inorganic pyrophosphatase，PPase，EC3.6.1.1） 由 基 因IPP1的編碼，該酶在控制生物體內無機焦磷酸濃度過程中起重要的作用。它催化一分子的焦磷酸脂轉化成兩分子正磷酸鹽離子［16］。圖4、表1可見Saccharomlyces cerevisiae FFC2146受到熱脅迫后細胞壁中的無機焦磷酸酶活性顯著提高，研究表明無機焦磷酸酶在催化焦磷酸水解的同時能夠提高細胞耐受非生物脅迫的能力［17］。焦磷酸水解是一個高放能的反應，因此該反應可以偶聯到一些不利于生物轉化的過程中，推動熱力學平衡向生物合成方向進行［18］。無機焦磷酸酶參與氧化磷酸化反應，可以控制體內ATP的生成，從而調節糖酵解途徑流向［19］。

釀酒酵母的碳代謝途徑主要為糖酵解（EMP）（88%）途徑和戊糖磷酸（HMP）（12%）途徑（圖5），與之相關的酶系分布在線粒體、內質網、液泡、細胞質膜及細胞壁上，其代謝調節比較復雜。研究表明與糖酵解有關的果糖-1，6-二磷酸激酶（Fructose-1，6-bisphosphatase），蘋果酸脫氫酶（Malate dehydrogenase）、異檸檬酸裂解酶（Isocitrate lyase）、磷酸烯醇式丙酮酸烯醇酶（PhosphoenolpyruvateCarboxykinase）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase）、親環蛋白（Cyclophilin）等酶在細胞壁中發揮作用［20］。EMP途徑中有三個不可逆反應步驟，分別由己糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶（Pyruvate kinase，PK）參與。EMP途徑中三個關鍵酶之一的丙酮酸激酶是EMP途徑最后一個關鍵步驟，即磷酸烯醇式丙酮酸的磷酰基團在PK的作用下，轉移到ADP上形成ATP，相應地磷酸烯醇式丙酮酸轉化為丙酮酸。蛋白質解析結果可見高溫脅迫下Saccharomlyces cerevisiae FFC2146的丙酮酸激酶表達關閉，說明EMP途徑受阻，其上游的6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶，3-磷酸甘油醛脫氫酶等酶的表達量亦下調。導致能量生成鏈的中間產物5-磷酸核酮糖和1，3-二磷酸甘油酸等合成減少。3-磷酸甘油醛脫氫酶已被鑒定為細胞壁的組成性蛋白［21］，1，3-二磷酸甘油酸合成受阻，導致糖酵解途徑中第一次底物水平磷酸化反應被破壞。受高溫脅迫的Saccharomlyces cerevisiae FFC2146胞內EMP途徑受到抑制后，在無機焦磷酸酶的調節作用下糖酵解流向發生改變，即EMP途徑的產物3-磷酸甘油醛進入HMP途徑（圖5），轉酮醇酶（Transketolase，TK）是關聯HMP途徑和EMP途徑的紐帶，戊糖和己糖途徑的紐帶［22］。TK 主要催化三磷酸甘油醛和六磷酸果糖反應產生五磷酸木糖和四磷酸赤癬糖，促進3-磷酸甘油醛和七磷酸景天庚酮糖轉變為五磷酸木糖和四磷酸赤癬糖［21］。可見，釀酒酵母受到外界非生物脅迫后通過改變糖代謝流向，獲取新陳代謝提供足夠的能量，維持生命。

表1 S. cerevisiae特異性變化的蛋白

3.3 Small GTPase GSP1P的耐熱機制

Small GTPase GSP1P是屬于鳥苷三磷酸酶超家族的一類單分子蛋白質，它是一種溫度敏感蛋白［23］。它可以通過活性與非活性狀態控制細胞內信號轉導通路的開關，使細胞內的蛋白質處于運輸狀態。Small GTPase Gsp1p主要與核過程有關，高溫脅迫后出現在酵母細胞壁，可能作為應急反應參與細胞膜的蛋白質輸送。

圖5 釀酒酵母的糖酵解途徑和磷酸戊糖途徑

4 結論

高溫脅迫的Saccharomlyces cerevisiae FFC2146細胞壁蛋白質中新增Ssa2和小分子鳥苷三磷酸酶，無機焦磷酸酶上調表達，而丙酮酸激酶缺消失，同時6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶和3-磷酸甘油醛脫氫酶下調表達。說明熱休克蛋白Ssa2保護細胞壁在高溫下保持完整，使細胞繼續生長繁殖；高溫脅迫下釀酒酵母的EMP糖酵解途徑受阻，在轉酮醇酶的作用下糖酵解途徑轉向HMP途徑，獲取足夠的能量，維持細胞正常的新陳代謝。

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（責任編輯李楠）

A Protein Differential Analysis of Cell Wall in Saccharomyces cerevisiae Under Different Temperatures

Gu Yue1Piao Yongzhe1，2Du Wei1Wang Xiaoyu1Wang Chunyan1
（1. College of Biological Engineering，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034；2 . College of Life Science，Dalian Nationalities University，Dalian 116600）

Living organisms undergo a series of stresses from abiotic environment， and these stresses will affect the changes of genetic transcription and the expression of protein for quick adaptation to the changing environment. Two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry were used to investigate the effects of high-temperature stresses on the proteome of cell wall in Saccharomyces cerevisiae. The results showed that， in S. cerevisiae FFC2146 under high temperature， proteins of cell walls had new Ssa2 and small molecules guanosine triphosphatase，inorganic pyrophosphatase was up-regulated， pyruvate kinase was deficient or even disappeared， and the expression of glucose-6-phosphate dehydrogenase and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase was down-regulated. These results indicated that the heat shock protein Ssa2 protected cell walls to be intact at a high temperature， therefore the cells grew and reproduced continuously；EMP glycolytic pathway of S. cerevisiae under heat stress was blocked， glycolytic pathway turned HMP pathway by transketolase， enough energy was obtained to maintain normal metabolism of cell.

Saccharomyces cerevisiae；two-dimensional electrophoresis；heat shock protein

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.029

2015-04-10

中央高校基本科研業務費專項（DC13010204）

谷月，女，碩士，研究方向：釀酒酵母蛋白質組學；E-mail：tingyue_678@126.com

樸永哲，男，博士，研究方向：分子生物學；E-mail：piaoyz@dlnu.edu.cn