‘易豐’女貞組培快繁技術(shù)體系的建立

孫英坤代其林張俊林王勁沈柏春陳林敬錢飛吳光洪

（1.杭州市園林綠化股份有限公司，杭州 310000；2.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，綿陽 621010；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

‘易豐’女貞組培快繁技術(shù)體系的建立

孫英坤1代其林2張俊林1王勁3沈柏春1陳林敬1錢飛1吳光洪1

（1.杭州市園林綠化股份有限公司，杭州 310000；2.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，綿陽 621010；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

以‘易豐’女貞（Ligustrum lucidum‘Yi Feng’）當(dāng)年新發(fā)半木質(zhì)化帶腋芽莖段為外植體，以芽繁芽的方式，建立了較為完善的可用于大規(guī)模工廠化生產(chǎn)的組培快繁技術(shù)體系。研究表明，最佳誘芽（啟動）培養(yǎng)基為WPM+ 0.3 mg/L Kinetin（KT）+ 0.1 mg/L 6-Benzylaminopurine（6-BA）+ 0.05 mg/L 1-Naphthylacetic acid（NAA），腋芽萌發(fā)率達(dá)到95.6%；最佳的增殖培養(yǎng)基為WPM+ 0.5 mg/L KT + 1.0 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L NAA，平均增殖系數(shù)達(dá)到5.63；最佳的生根培養(yǎng)基為1/2WPM+ 1.5 mg/L 3-Indolebutyric acid（IBA）+ 0.1 mg/L NAA，生根周期約為20 d，生根率約為95.4%，煉苗移栽后成活率達(dá)到95%以上。建立的組培技術(shù)體系能夠滿足產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的需要，得到的組培苗后代能夠穩(wěn)定地遺傳親本的優(yōu)良變異性狀。

‘易豐’女貞；快速繁殖；增殖培養(yǎng)

易豐’女貞（Ligustrum lucidum‘Yi Feng’）是一種野生變異的新品種，由于其種質(zhì)資源極為有限，通過常規(guī)的繁育方法難以在較短時間內(nèi)實(shí)現(xiàn)大規(guī)模擴(kuò)繁，公司科研人員于2008年5月在浙江省天目山自然保護(hù)區(qū)發(fā)現(xiàn)一自然變異的女貞突變體（圖1）。該突變體小枝棕綠色，無毛；葉片軟革質(zhì)7，卵形、橢圓形或?qū)挋E圓形，葉長1-3 cm，寬 0.7-1.7 cm，長寬比約為2∶1，先端漸尖或鈍，葉全緣，新葉的邊緣黃綠色（RHS-12A），中間綠色（RHS-144A），而老葉邊緣淺黃色（RHS-8C），中間深綠色（RHS-146C），葉上面光亮，兩面無毛，中脈在上面凹入，下面凸起，側(cè)脈2-4對，葉柄長0.1-0.2 cm，上面具溝，無毛；圓錐花序頂生，長2-7 cm，寬2-4 cm，花序軸無毛。將該突變體命名為‘易豐’女貞，并選取其中優(yōu)良單株，種植到公司的種質(zhì)資源圃。

由于‘易豐’女貞是雌雄同株異位，導(dǎo)致自花授粉困難，坐果率極低，因此難以用種播的方式進(jìn)行繁育。用扦插進(jìn)行繁育，會受到季節(jié)及插穗質(zhì)量、數(shù)量的限制，難以在短時間內(nèi)獲得大量種苗。通過組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)進(jìn)行繁育，所需要的試驗(yàn)材料少，能夠在較短時間內(nèi)獲得大量規(guī)格一致、保持親本優(yōu)良變異性狀、質(zhì)量上乘的苗木。

該研究以腋芽繁芽的方式進(jìn)行大量的后代擴(kuò)繁，而之前有關(guān)女貞屬物種組培技術(shù)的相關(guān)報道大都是以莖段或種子為外植體材料，誘導(dǎo)獲得愈傷組織，然后愈傷組織再分化成芽的方式進(jìn)行的［1-3］。在植物組培快繁的過程中采用莖尖或者腋芽誘導(dǎo)（叢生）芽的方式進(jìn)行，比外植體經(jīng)過脫分化形成愈傷組織，然后愈傷組織再分化成幼苗的途徑更能很好地遺傳親本的優(yōu)良性狀，不容易發(fā)生變異［4，5］。迄今為止，關(guān)于女貞組培的相關(guān)報道均是停留在基礎(chǔ)研究的水平上，并未形成大規(guī)模的工廠化生產(chǎn)，而本研究首次針對‘易豐’女貞的組培快繁技術(shù)進(jìn)行系統(tǒng)的探索，建立一套完整的組培快繁技術(shù)體系，以期能成功進(jìn)行大規(guī)模的工廠化生產(chǎn)。

圖1 ‘易豐’女貞的野生優(yōu)良單株

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 以公司種質(zhì)資源圃中野生優(yōu)良的‘易豐’女貞（Ligustrum lucidum‘Yi Feng’）植株為取材母株，在4-5月的晴天上午，選取健壯、無病蟲害、當(dāng)年新發(fā)帶腋芽的幼嫩半木質(zhì)化莖段為外植體材料。

1.1.2 消毒處理 先將嫩梢的葉片沿葉柄基部剪掉，再將嫩梢切成幾段。莖段用0.3%新潔爾滅溶液浸泡，在磁力攪拌器上旋轉(zhuǎn)處理40 min。然后在流水下沖洗1 h，轉(zhuǎn)入超凈工作臺上，用無菌水沖洗一遍，再用75%的酒精浸泡30 s左右，然后用1%的次氯酸鈉溶液消毒處理10 min，最后用無菌水沖洗4-5次，其間不斷搖動，保證消毒液、無菌水與外植體充分接觸。

1.2 方法

1.2.1 誘芽（啟動）培養(yǎng)基的篩選 將消毒后的外植體莖段剪成1.5 cm左右的小段，每段上有1個腋芽，接種到誘芽培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)。誘芽培養(yǎng)以MS、WPM、B5培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，分別添加KT（0.1、0.2和0.3 mg/L）、6-BA（0.1、0.5和1.0 mg/L），NAA（0.01、0.05和0.1 mg/L），蔗糖用量為30 g/L，瓊脂用量為6 g/L，pH為5.8-6.0。采用L（934）的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選最佳的誘芽培養(yǎng)基配方，每個處理接種50瓶，每瓶接種2個外植體莖段，重復(fù)3次。培養(yǎng)30 d后，統(tǒng)計(jì)腋芽萌發(fā)率。以腋芽萌發(fā)率為評價指標(biāo)，篩選最佳誘芽培養(yǎng)基。

1.2.2 增殖培養(yǎng)基的篩選 外植體莖段在誘芽培養(yǎng)基上培養(yǎng)1個月左右，外植體莖段上的腋芽在誘芽培養(yǎng)基上萌發(fā)，抽出新的側(cè)芽，將新抽出的側(cè)芽剪成1.5 cm左右的小段，每段上有1個腋芽，接種到增殖培養(yǎng)基上。

增殖培養(yǎng)以WPM為基本培養(yǎng)基，分別添加KT（0.3、0.5和1.0 mg/L）、6-BA（0.5、0.8和1.0 mg/L），NAA（0.05、0.1和0.2 mg/L），蔗糖用量為30 g/L，瓊脂用量為6 g/L，pH為5.8-6.0。采用L9（34）的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選最佳的增殖培養(yǎng)基配方，每個處理接種20瓶，每瓶接種5個腋芽小段，重復(fù)3次。培養(yǎng)50 d后，統(tǒng)計(jì)平均增殖系數(shù)、側(cè)芽平均高度。平均增殖系數(shù)=增殖培養(yǎng)后所獲得的腋芽總數(shù)/增殖培養(yǎng)前腋芽總數(shù)。以平均增殖系數(shù)為主要評價指標(biāo)，以側(cè)芽平均高度為次要評價指標(biāo)，篩選最佳增殖培養(yǎng)基。

1.2.3 生根培養(yǎng)基的篩選 經(jīng)過1.5-2個月以后，腋芽經(jīng)過增殖培養(yǎng)長成3 cm左右的健壯小苗，將小苗基部的愈傷組織切除，接種到生根培養(yǎng)基上。

生根培養(yǎng)分別以WPM、1/2WPM和1/4WPM為基本培養(yǎng)基，分別添加IBA（0、1.5和2.0 mg/L）、NAA（0、0.05和0.1 mg/L），活性炭（AC）的用量為1 m/L，蔗糖用量為20 g/L，瓊脂用量為6 g/L，pH為5.8-6.0。采用L9（34）的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選最佳的生根培養(yǎng)基配方，每個處理接種20瓶，每瓶接種5棵小苗，重復(fù)3次。培養(yǎng)40 d后，以生根率為主要評價指標(biāo)，以平均單株苗生根條數(shù)和單株生根苗根系平均長度為次要評價指標(biāo)，篩選最佳生根培養(yǎng)基。

1.2.4 培養(yǎng)條件 以上所有培養(yǎng)基和超凈工作臺內(nèi)所用器皿均是經(jīng)過121℃高溫高壓滅菌20 min。誘芽（啟動）培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為：（25±2）℃，光照12 h/d，光照強(qiáng)度2 000-2 500 Lx，濕度60%-65%。

1.2.5 煉苗及移栽（精練方法，部分?jǐn)?shù)據(jù)放在結(jié)果中）

將生根的組培苗轉(zhuǎn)移到煉苗坑道中的苗床上，自然環(huán)境下煉苗15-20 d。移栽前3-4 d，將組培瓶的瓶蓋松動，但不要完全打開，移栽前1-2 d，將組培瓶的瓶蓋完全打開，并往組培瓶內(nèi)灌入少量的無菌水。生根組培苗移栽前，先用鑷子將生根苗輕輕地從培養(yǎng)基內(nèi)夾出來，將根部所帶的培養(yǎng)基用清水完全清洗干凈，不要損傷苗的根部。將清洗好的生根苗輕輕插入煉苗基質(zhì)。生根苗不宜種的過深，盡量使根部舒展地分布于基質(zhì)中，不要使其彎曲。然后用塑料薄膜做成封閉的小拱棚，保溫保濕。

2 結(jié)果

2.1 外植體的消毒處理

該研究針對‘易豐’女貞帶有腋芽的半木質(zhì)化莖段所進(jìn)行的外植體消毒處理方案是在特定季節(jié)、特定環(huán)境和特定的取材母本材料下制定的，經(jīng)過消毒處理后，外植體的污染率可以基本控制在10%-15%，外植體死亡率可以基本控制在5%-10%。

2.2 最佳誘芽（啟動）培養(yǎng)基的篩選

經(jīng)過消毒處理后，大部分帶有腋芽的外植體莖段能保持腋芽的活性。外植體莖段接種到合適的誘芽培養(yǎng)基上以后，經(jīng)過7 d左右，腋芽開始萌動。經(jīng)過20-30 d左右，腋芽抽出約5 cm左右的側(cè)芽（圖2）。從表1中可以明顯地看出，休眠腋芽在9種誘芽培養(yǎng)基上，經(jīng)過一定時間以后，均能萌發(fā)，但腋芽開始萌動抽芽的時間和萌發(fā)率存在較大的差異。其中處理4、處理5和處理6三種培養(yǎng)基上的外植體莖段，接種約5 d后，大部分腋芽就開始萌動；約20 d后，腋芽就能分化成6-8 cm左右的側(cè)芽，腋芽萌發(fā)率均很高，在90%以上，且長勢良好。處理1、處理2和處理3三種培養(yǎng)基上的外植體莖段，接種約7-14 d后，大部分腋芽開始萌動；約30 d后，腋芽能分化成5 cm左右的側(cè)芽，腋芽萌發(fā)率均較高，在70%以上，且長勢良好。處理7、處理8和處理9三種培養(yǎng)基上的外植體莖段，接種約7-14 d后，大部分腋芽開始萌動；約30 d后，腋芽就能分化成5 cm左右的側(cè)芽，但腋芽萌發(fā)率最低，均低于35%，且長勢一般。

圖2 ‘易豐’女貞的誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)

不同誘芽（啟動）培養(yǎng)基因?qū)Α棕S’女貞外植體莖段膠芽萌發(fā)的影響如表1所示，極差值大小表現(xiàn)為基本培養(yǎng)基＞KT濃度＞6-BA濃度＞NAA濃度，說明基本培養(yǎng)基的選擇對易豐女貞腋芽萌發(fā)率的影響最大，KT的濃度影響次之，而6-BA 和NAA的濃度影響均很小，因此，在誘芽培養(yǎng)的過程中，選擇WPM作為誘芽培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基，腋芽萌發(fā)率最高，處理6上接種的外植體，腋芽萌發(fā)率達(dá)到峰值，為95.6%，結(jié)合腋芽開始萌動的時間及側(cè)芽的長勢來綜合考慮，處理6（WPM+ 0.3 mg/L KT + 0.1 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L NAA）為最佳的誘芽培養(yǎng)基。

表1 不同誘芽（啟動）培養(yǎng)基對‘易豐’女貞外植體莖段腋芽萌發(fā)的影響

2.3 最佳增殖培養(yǎng)基的篩選

接種到增殖培養(yǎng)基上的腋芽莖段，經(jīng)過1.5-2個月左右的生長，增殖產(chǎn)生了大量的側(cè)芽（圖3-A），部分分化產(chǎn)生了不定芽（圖3-B）。而這些側(cè)芽或不定芽經(jīng)過伸長生長，分化為側(cè)枝，繼而可以將側(cè)枝再剪成若干帶有腋芽的小段，繼續(xù)進(jìn)行增殖培養(yǎng)，經(jīng)過若干代的增殖培養(yǎng)，便可以通過這種芽繁芽的方式得到大量子代植株。增殖培養(yǎng)可以理解為更大規(guī)模的啟動培養(yǎng)，因此啟動培養(yǎng)過程中所選擇的基本培養(yǎng)基和相關(guān)激素的種類、配比及濃度等與增殖培養(yǎng)具有一定的相關(guān)性，基于這個原理，我們在增殖培養(yǎng)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)過程中借助了啟動培養(yǎng)的試驗(yàn)結(jié)果，并進(jìn)行了相關(guān)分析。

圖3 ‘易豐’女貞的增殖培養(yǎng)

通過以上對啟動培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果的分析，在增殖培養(yǎng)的過程中，繼續(xù)選擇WPM作為基本的培養(yǎng)基。表2顯示，KT濃度對于側(cè)芽增殖效果的影響作用最大，NAA濃度次之，6-BA濃度最小。因此，在增殖培養(yǎng)的過程中，KT濃度的選擇至為關(guān)鍵。當(dāng)KT濃度為0.5 mg/L時，平均增殖系數(shù)在4以上，側(cè)芽平均高度達(dá)到了8 cm以上，增殖效果較好；當(dāng)KT濃度提高到1.0 mg/L時，平均增殖系數(shù)明顯提高，達(dá)到5.5以上，但側(cè)芽的長勢很差，平均高度只有1.5 cm左右，而且幼苗出現(xiàn)了一定程度的玻璃化現(xiàn)象；KT濃度為0.3 mg/L時，平均增殖系數(shù)在3以上，側(cè)芽平均高度也較理想，但部分葉片出現(xiàn)卷曲黃化的現(xiàn)象。因此，以平均增殖系數(shù)為主要評價指標(biāo)的基礎(chǔ)上，結(jié)合側(cè)芽的長勢情況來綜合考慮，處理6（WPM+ 0.5 mg/L KT + 1.0 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L NAA）為最佳的增殖培養(yǎng)基。

2.4 最佳生根培養(yǎng)基的篩選

增殖培養(yǎng)結(jié)束以后，挑選健壯、生長狀況良好，葉片數(shù)量較多的再生苗，將其剪成3 cm左右，接種到生根培養(yǎng)基上。40 d左右以后，大部分苗會在愈傷基部產(chǎn)生不定根，但不同處理的培養(yǎng)基上再生苗生根的時間存在很大的差異。在處理6和處理8中，接種后約5 d，基部開始產(chǎn)生不定根（圖4-A），約20 d后，大量的根系產(chǎn)生（圖4-B），而且生根率和根系數(shù)量也較為理想，但最終產(chǎn)生的根系過長，不利于后續(xù)的移栽，降低煉苗成活率；在處理2、處理3、處理5和處理9中，接種后約7-10 d，基部開始產(chǎn)生不定根（圖4-C），約20 d，大量的根系產(chǎn)生，但只有處理5（圖4-D）產(chǎn)生的根系長度比較合適，其他幾個處理產(chǎn)生的根系長度也過長（圖4-E）；處理4和處理7，接種后約14-20 d，傷口基部才開始產(chǎn)生不定根，約50 d后，大量的根系產(chǎn)生，而且在傷口基部產(chǎn)生大量的愈傷組織塊，根系數(shù)量相比其他幾個處理多，但根系很短粗（圖4-F），極易發(fā)生折斷現(xiàn)象；處理1是空白培養(yǎng)基對照，生根時間很長，直到接種后約2個月產(chǎn)生根系，且生根效果也較差。

圖4 易豐’女貞的生根培養(yǎng)

表2 不同增殖培養(yǎng)基對‘易豐’女貞腋芽增殖的影響

表3顯示，基本培養(yǎng)基的極差值最大，亦即對生根效果的影響最大；NAA濃度的極差值次之，對生根效果的影響較大；IBA濃度的極差值最小，對生根效果的影響最小。在實(shí)驗(yàn)過程中，一個很重要的現(xiàn)象引起了我們的注意：只添加NAA的生根培養(yǎng)基上，苗基部的傷口產(chǎn)生大量的愈傷組織，在愈傷組織上產(chǎn)生數(shù)量非常龐大的不定根，但是根系很短且粗，極易發(fā)生折斷；而只添加IBA的生根培養(yǎng)基上，苗基部的傷口幾乎不產(chǎn)生愈傷組織，直接在基部產(chǎn)生根系，但根系過長；IBA和NAA配合使用，生根效果較好。

綜合考慮，處理5（1/2WPM+ 1.5 mg/L IBA + 0.1 mg/L NAA+1 mg/L AC）為最佳的生根培養(yǎng)基。

2.5 組培苗馴化及煉苗移栽

煉苗基質(zhì)由珍珠巖和泥炭充分混勻組成（珍珠巖∶泥炭=1∶1，V/V），移栽前1周左右，用0.8%的高錳酸鉀溶液對其消毒處理，然后用塑料薄膜覆蓋。生根苗清洗干凈以后（圖5），輕輕插入煉苗基質(zhì)（圖6），對移栽的生根苗均勻噴施0.3%的多菌靈溶液，以基質(zhì)完全浸濕為宜，然后密閉小拱棚內(nèi)保溫保濕約40 d。待生根小苗長出新的須狀根并恢復(fù)正常生長后（圖7），將小拱棚的兩端打開，緩慢放風(fēng)，約1周后，將小拱棚完全打開，使其在自然條件下生長，此后，約每2周對生根苗噴施一次0.5%的硫酸亞鐵溶液，持續(xù)約2個月，組培苗成活率可以達(dá)到95%以上。

表3 不同生根培養(yǎng)基對‘易豐’女貞組培苗生根的影響

圖5 易豐’女貞待移栽的組培苗

圖6 ‘易豐’女貞移栽到煉苗基質(zhì)上的組培苗

圖7 ‘易豐’女貞煉苗后成活的組培苗

3 討論

3.1 外植體的消毒處理

自然環(huán)境下取材的外植體消毒處理是否成功，取決于親本生長環(huán)境、溫度濕度、季節(jié)、取材時機(jī)和取材部位等很多因素，包括消毒劑的類型選擇、消毒劑的濃度和消毒時間等也極為關(guān)鍵，消毒劑不僅影響外植體的表面消毒效果，而且對隨后外植體的腋芽生長也有較大影響［6］，這就決定了難以形成統(tǒng)一的消毒處理方式和方法，均需要結(jié)合一定的實(shí)際經(jīng)驗(yàn)加以摸索［7］，但不管采用何種消毒方式和方法，最終都以實(shí)現(xiàn)有效徹底地消除外植體表面所附帶的細(xì)菌、真菌及其他污染物的同時，最大限度地保持外植體的活性為標(biāo)準(zhǔn)。

3.2 誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)和增殖培養(yǎng)

在‘易豐’女貞誘導(dǎo)腋芽啟動培養(yǎng)的研究過程中，根據(jù)自身多年的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，考慮到盡量節(jié)約后期的生產(chǎn)成本，所以首先采用6-BA +NAA較為常規(guī)的使用濃度進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，但是效果很差，繼而在此基礎(chǔ)上分別提高和降低了原來的使用濃度，而且濃度跨度范圍很大，但是腋芽的萌發(fā)率也只有10%左右，而且生長狀況較差。在后續(xù)的研究過程中，又采用了KT +NAA的組合，按照之前的研究思路繼續(xù)進(jìn)行試驗(yàn)，啟動培養(yǎng)的效果依然沒有太大改觀。因此在正式的試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)過程中，試著采用了KT+6-BA+NAA的組合，依然采用了較為常規(guī)的使用濃度，這種研究方案成功地誘導(dǎo)了絕大多數(shù)的腋芽萌發(fā)，且新抽出的側(cè)芽生長狀況極好。在接下來的增殖培養(yǎng)研究過程中，繼續(xù)采用此種激素配比模式，在啟動培養(yǎng)的基礎(chǔ)上調(diào)整了其濃度，結(jié)果也取得了很好的增殖效果。

植物腋芽萌發(fā)和芽的增殖，往往是其體內(nèi)不同種激素相互促進(jìn)或拮抗的過程，多種激素的綜合作用影響了植物細(xì)胞的生長和定向分化［8］。激素濃度、種類及不同組合對外植體的誘導(dǎo)和分化起著重要的作用［9］。對大多數(shù)植物來說，為了達(dá)到腋芽萌發(fā)或者芽增殖的目的，采用單一的細(xì)胞分裂素+單一的生長素，配合使用一定濃度，就可以取得不錯的試驗(yàn)效果，王港等［10］在杉木無性系規(guī)模化組培繁育技術(shù)研究中發(fā)現(xiàn)1.0 mg/L 6-BA+ 0.3 mg/L IBA的組合就能產(chǎn)生較高的增殖系數(shù)，李曉玲等［11］在山櫻花組培快繁技術(shù)研究中提出0.4 mg/L 6-BA + 0.02 mg/L NAA的組合就能使其增殖系數(shù)達(dá)到4.0以上，但是這種方式并不適用于‘易豐’女貞。針對這種現(xiàn)象，研究者推測，‘易豐’女貞的植物體內(nèi)所含有的內(nèi)源生長素的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了內(nèi)源細(xì)胞分裂素，二者的比值形成了一種穩(wěn)定的動態(tài)平衡。當(dāng)用單一種外源的細(xì)胞分裂素來刺激植物體時，即使所用的濃度較高，也很難打破這種內(nèi)在的動態(tài)平衡，也就無法使它按照預(yù)期的設(shè)想來定向分化（腋芽萌發(fā)、增殖）。只有用一定濃度兩種或兩種以上的細(xì)胞分裂素結(jié)合較低濃度的生長素，才有可能打破這種內(nèi)在的動態(tài)平衡，從而實(shí)現(xiàn)預(yù)期的結(jié)果。由于受試驗(yàn)條件、人力物力、生產(chǎn)成本等一些客觀因素的制約，并沒有采用兩種以上其他的細(xì)胞分裂素組合來驗(yàn)證以上這種設(shè)想的機(jī)制，因此該研究所提到的最佳啟動培養(yǎng)基和最佳增殖培養(yǎng)基，僅是在現(xiàn)有特定的條件下最科學(xué)、高效、完善的，除此之外，亦可能有其他較為高效的培養(yǎng)基配方，本研究未做更深入的研究。

3.3 誘導(dǎo)組培苗生根

在生根體系的研究過程當(dāng)中，試驗(yàn)結(jié)果分析中所提到的重要現(xiàn)象，亦或許在一定程度上驗(yàn)證了以上所設(shè)想的機(jī)制，‘易豐’女貞的植物體內(nèi)所含有的內(nèi)源NAA的量非常高，所以當(dāng)只加入較低濃度NAA時，莖基部傷口就會先產(chǎn)生大量的愈傷組織，低濃度的NAA就能打破內(nèi)源激素的動態(tài)平衡。當(dāng)加入濃度適量的NAA，使NAA/細(xì)胞分裂素達(dá)到一定值的時候，就能誘導(dǎo)莖基部產(chǎn)生大量粗短的不定根。但所產(chǎn)生的這種不定根，是在愈傷組織的基礎(chǔ)上分化出來的，稱之為愈傷根。單獨(dú)加入IBA來誘導(dǎo)生根，莖基部傷口只產(chǎn)生少量甚至不產(chǎn)生愈傷組織，直接在傷口處產(chǎn)生不定根，根系數(shù)量適中但很長，稱之為皮部根。總體上來看，更希望得到皮部根，因?yàn)槠げ扛母蹬c莖維管系統(tǒng)的連接比愈傷根更順暢，這樣就容易提高后期組培苗煉苗移栽的成活率。組培苗的煉苗成活率很大程度上與根系的質(zhì)量有關(guān)，不定根粗壯、毛細(xì)根較多、根系長度適中等能夠擴(kuò)大根系吸收面積，增強(qiáng)根系吸收能量，從而也達(dá)到了提高移栽成活率的目的［12］。因此，在實(shí)際的組培生產(chǎn)過程中，采用IBA和NAA配合使用，更能提高生根效率。

通過該研究建立的組培技術(shù)體系所得到的組培苗后代性狀穩(wěn)定優(yōu)良、品質(zhì)高、抗逆性較強(qiáng)。不僅在短時間內(nèi)為市場上提供了大量的新優(yōu)苗木，更重要的是，為更多新優(yōu)品種組培快繁技術(shù)體系的研究提供了一定的理論支持和技術(shù)指導(dǎo)，具有一定的經(jīng)濟(jì)和社會效應(yīng)。

4 結(jié)論

本研究建立了能夠?qū)崿F(xiàn)大規(guī)模工廠化生產(chǎn)的‘易豐’女貞組培快繁體系。最佳的誘芽培養(yǎng)基為 WPM+ 0.3 mg/L KT+0.1 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA；最佳的增殖培養(yǎng)基為WPM+ 0.5 mg/L KT + 1.0 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L NAA；最佳的生根培養(yǎng)基為1/2WPM+ 1.5 mg/L IBA + 0.1 mg/L NAA+1 g/L AC。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

The Establishment of Tissue Culture and Rapid Propagation System of Ligustrum lucidum ‘Yi Feng’

Sun Yingkun1Dai Qilin2Zhang Junlin1Wang Jin3Shen Bochun1Chen Linjing1Qian Fei1Wu Guanghong1
（1. Hangzhou Landscaping Incorporated Company，Hangzhou 310000；2. College of Life Science and Technology，Southwest University of Science and Technology，Mianyang 621010；3. Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）

Ligustrum lucidum‘Yi Feng’， a wild and variant species， because its resource was very scarce， and routine methods could not achieve large-scale propagation during a short period of time， a relatively perfect tissue culture and rapid propagation system for massive production was established in this research with axillary buds of young branch cuttings as explant materials. The results showed that， the optimal initial medium was WPM+ 0.3 mg/L KT + 0.1 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L NAA， and the germination frequency of axillary buds reached 95.6%；the optimal proliferation medium was WPM+ 0.5 mg/L KT + 1.0 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L NAA， and its average proliferation coefficient reached 5.63；the optimal rooting medium of shoots was 1/2WPM+ 1.5 mg/L IBA + 0.1 mg/L NAA. After about 20 days， the overall frequency of shoots rooting reached about 95.4%. And then， more than 95% of the plantlets could survive on the substrate soil in the end. The system can satisfy the need of industrial production， and the plantlets can steadily inherit the outstanding variation character of parents.

Ligustrum lucidum ‘Yi Feng’；rapid propagation；proliferation culture

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.014

2015-03-25

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（2013CB733903），國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（2012AA063503），農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201103007）

孫英坤，男，工程師，碩士研究生，研究方向：園林植物組培快繁；E-mail：sunyingkun4@163.com

吳光洪，男，高級工程師，研究方向：園林植物研究與開發(fā)；E-mail：498548490 @qq.com