一種檢測(cè)線粒體核酸酶靶向剪切活性的新方法

魏迪高敬池振奮張癸榮聶凌云

（1.河北北方學(xué)院，張家口 075000；2.中國(guó)人民解放軍總后勤部衛(wèi)生部藥品儀器檢驗(yàn)所，北京 100071；3.中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所，北京 100101）

一種檢測(cè)線粒體核酸酶靶向剪切活性的新方法

魏迪1，2高敬1，2池振奮3張癸榮1，2聶凌云1，2

（1.河北北方學(xué)院，張家口 075000；2.中國(guó)人民解放軍總后勤部衛(wèi)生部藥品儀器檢驗(yàn)所，北京 100071；3.中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所，北京 100101）

旨在建立一種簡(jiǎn)便檢測(cè)線粒體DNA（mtDNA）核酸酶靶向剪切活性的方法。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將一段含有兩個(gè)靶向目標(biāo)序列（T1、T2）的線粒體DNA序列隨機(jī)整合到宿主基因組中，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR篩選單拷貝或低拷貝的單克隆轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株。將含有T1、T2的CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）/Cas9質(zhì)粒分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到所選細(xì)胞株中，靶向剪切核基因組，在靶向目標(biāo)序列處造成DNA雙鏈斷裂，引發(fā)非同源末端連接修復(fù)機(jī)制，引入插入或缺失突變。觀察測(cè)序峰圖，證明兩個(gè)靶向目標(biāo)序列T1、T2均有剪切效率，且T1高于T2。建立了一種高效快速檢測(cè)線粒體核酸酶靶向剪切活性的新方法。

線粒體核酸酶；轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株；靶向修飾；CRISPR/Cas9；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

隨著測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，我們獲得越來(lái)越多的遺傳信息。研究人員試圖通過(guò)對(duì)特定靶向基因的破壞或敲除來(lái)研究它們的相關(guān)功能。與傳統(tǒng)基因打靶技術(shù)相比，新型基因組編輯技術(shù)應(yīng)用范圍更廣、作用效率更高、所需成本更低，可用于模式動(dòng)物構(gòu)建、基因功能研究、基因治療等方面。

目前，常用的基因組編輯技術(shù)主要包括以下3種：鋅指蛋白（Zinc finger proteins，ZFPs）技術(shù)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子（Transcription activator-like effectors，TALEs）技術(shù)、CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）技術(shù)。它們的大致原理都是通過(guò)造成靶向DNA雙鏈斷裂（doublestrand breaks，DSBs），引發(fā)細(xì)胞內(nèi)固有的非同源末端連接（Nonhomologous end joining，NHEJ）［1］或同源重組（Homology-directed repair，HDR）［2］兩種修復(fù)機(jī)制對(duì)DSBs處進(jìn)行修復(fù)，從而實(shí)現(xiàn)基因的定點(diǎn)敲除、敲入或缺失。3種技術(shù)在具體操作方式上又有所不同。

鋅指核酸酶（Zinc-finger nuclease，ZFN）與轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶（Transcription activatorlike effector nulease，TALEN）這兩種人工核酸內(nèi)切酶，均由DNA識(shí)別域與非特異性核酸內(nèi)切酶Fok I融合而成。其中，ZFN的鋅指模塊識(shí)別三聯(lián)體堿基，在序列的識(shí)別上靈活性小，設(shè)計(jì)成本昂貴、技術(shù)被少數(shù)公司壟斷，這些都限制了它的發(fā)展［3］。TALEN在結(jié)構(gòu)上較之ZFN更加優(yōu)化。其DNA結(jié)合域中的各單元可與靶向目標(biāo)序列一一對(duì)應(yīng)，組裝更為簡(jiǎn)單，特異性更高。2013年，一種源自細(xì)菌適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的CRISPR/Cas9的出現(xiàn)，為基因靶向修飾領(lǐng)域帶來(lái)了巨大變革。主要原理：向?qū)NA（guide RNA，gRNA）與Cas9核酸酶形成的復(fù)合物，在gRNA指導(dǎo)下與靶向目標(biāo)序列結(jié)合，由靶向目標(biāo)序列下游的原型間隔序列相鄰基序（Protospacer adjacent motifs，PAM）激活Cas9核酸酶［4］，使其對(duì)PAM上游3 nt處剪切造成DSBs。該系統(tǒng)較之前兩種，應(yīng)用范圍更廣、作用效率更高、使用成本更低，經(jīng)過(guò)短短兩年的發(fā)展，已被用于世界各地的實(shí)驗(yàn)室［5］。

線粒體是存在于大多數(shù)真核生物細(xì)胞中的細(xì)胞器，有“細(xì)胞中的能量工廠”之稱(chēng)。它主要通過(guò)氧化磷酸化以三羧酸循環(huán)腺苷（ATP）的形式為細(xì)胞活動(dòng)提供能量。同時(shí)，還參與諸如鐵硫簇的生物合成、鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)［6］、細(xì)胞分化、細(xì)胞信息傳遞和細(xì)胞凋亡［7］等過(guò)程，并且擁有調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞周期的能力。線粒體基因組，又稱(chēng)線粒體DNA（mtDNA）。長(zhǎng)度一般為幾萬(wàn)至數(shù)十萬(wàn)堿基對(duì)，人類(lèi)mtDNA為16 569 bp，共編碼2個(gè)rRNA、13個(gè)多肽、22個(gè)tRNA?；蚺帕芯o湊，除與mtDNA復(fù)制及轉(zhuǎn)錄有關(guān)的一小段區(qū)域外，無(wú)內(nèi)含子序列［8］。mtDNA表現(xiàn)為母系遺傳，突變率高，是細(xì)胞核內(nèi)DNA的10倍左右。且mtDNA突變是導(dǎo)致人類(lèi)線粒體遺傳病及衰老性疾病的重要原因之一。研究表明，它與衰老及神經(jīng)退行性病變?nèi)绨柎暮ＤY、帕金森氏病等老年化疾病有關(guān)，同時(shí)也與腫瘤的形成密切相關(guān)［9］。截至目前，已鑒定出超過(guò)500多個(gè)致病性突變來(lái)自mtDNA。而針對(duì)mtDNA致病性突變的精確改造能力則相對(duì)缺乏［10］。

隨著Minczuk等［11，12］將ZFN作用于mtDNA，Bacman等［13］首次將TALEN用于清除病人線粒體內(nèi)的突變型mtDNA。這兩種基于ZFPs技術(shù)、TALEs技術(shù)的線粒體核酸酶都為更好的進(jìn)行線粒體功能研究、線粒體遺傳病的治療等提供了可能。此外，本實(shí)驗(yàn)室也基于人工CRISPR/Cas9系統(tǒng)獨(dú)特地構(gòu)建了作用于mtDNA的mtCRISPR/Cas9系統(tǒng)（結(jié)果未發(fā)表）。

任何一種基因組編輯技術(shù)，它的靶向剪切效率、切割特異性等問(wèn)題不可回避。由于核基因組中的DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)比較完整，當(dāng)發(fā)生DSBs時(shí)，可通過(guò)NHEJ修復(fù)在靶向目標(biāo)序列處引入插入或缺失突變。因此，改造核基因組的相關(guān)基因組編輯技術(shù)可通過(guò)錯(cuò)配酶法、靶向目標(biāo)序列直接PCR后TA克隆測(cè)序或觀察靶向目標(biāo)序列測(cè)序峰圖等方法鑒定。而相應(yīng)的線粒體基因組編輯工具，由于線粒體缺乏完善的DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)［14-16］，修復(fù)能力較弱，無(wú)法通過(guò)上述方法檢測(cè)。

因此，本研究利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將一段含有靶向目標(biāo)序列的mtDNA序列隨機(jī)整合到宿主基因組中，獲得轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株。通過(guò)相應(yīng)的核基因組編輯技術(shù)靶向剪切該細(xì)胞株的核基因組，對(duì)靶向目標(biāo)序列處造成DSBs引發(fā)NHEJ修復(fù)。觀察靶向目標(biāo)序列測(cè)序峰圖，鑒定mtDNA的靶向目標(biāo)序列剪切活性。建立了一種檢測(cè)線粒體核酸酶靶向剪切活性的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)用載體及細(xì)胞株 所用載體為哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體pEGFP-N1，帶EGFP標(biāo)簽，購(gòu)自Clontech公司。所用細(xì)胞株為人腎上皮細(xì)胞HEK293，培養(yǎng)條件：DMEM+10%FBS。

1.1.2 主要藥品及試劑 DL2 000 DNA Marker、dNTP、RNase A、T4 DNA Ligase、LA Taq、SYBR premix Ex Taq等均購(gòu)自TaKaRa公司。膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、基因組提取試劑盒均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，測(cè)序由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 pEGFP-mtDNA轉(zhuǎn)基因單克隆細(xì)胞株的獲得

1.2.1.1 pEGFP-mtDNA重組克隆質(zhì)粒的構(gòu)建 以pEGFP-N1為載體，將一段同時(shí)含有兩個(gè)靶向目標(biāo)序列（T1、T2）的mtDNA序列與EGFP的N端融合，除去EGFP前的起始密碼子ATG，最終得到重組克隆質(zhì)粒：pEGFP-mtDNA。

具體步驟如下：（1）以HEK293細(xì)胞基因組DNA為模板，用CL-F1/CL-R1引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增（335 bp），膠回收后得產(chǎn)物J；（2）以產(chǎn)物J為模板，用CL-F2/CL-R2（CL-F2帶有flag標(biāo)簽，如表1橫線部分所示）引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增（167 bp），膠回收后得產(chǎn)物K；（3）以產(chǎn)物K為模板，用CL-F3/CL-R3（CL-F3帶有Nhe I酶切位點(diǎn)和flag標(biāo)簽、CL-R3帶有Age I酶切位點(diǎn)，如表1相應(yīng)下劃線、下劃線斜體部分所示）引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增（194 bp），得產(chǎn)物L(fēng)；（4）對(duì)純化后的產(chǎn)物L(fēng)及pEGFP-N1質(zhì)粒做Nhe I/Age I雙酶切，分別以此為插入片段及載體進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、挑單克隆鑒定、鑒定正確樣品測(cè)序；（5）以上一步驟中的正確質(zhì)粒為模板，用CL-F4/CL-R4引物對(duì)（CL-F4帶有Age I酶切位點(diǎn)，如表1橫線斜體部分所示；刪去EGFP起始密碼子ATG，添加一個(gè)堿基C調(diào)整編碼框，該堿基的選擇應(yīng)避免引入終止密碼子）進(jìn)行PCR擴(kuò)增（902 bp），得產(chǎn)物M；（6）對(duì)純化后的產(chǎn)物M及上一步驟所用質(zhì)粒做Age I/Not I雙酶切，分別以此為插入片段及載體進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、挑單克隆鑒定、鑒定正確樣品測(cè)序，即得最終質(zhì)粒：pEGFP-mtDNA（圖1）。

表1 pEGFP-mtDNA重組克隆質(zhì)粒構(gòu)建相關(guān)引物

1.2.1.2 陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株初篩 將pEGFP-mtDNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)于60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的HEK293細(xì)胞中，24 h后，將細(xì)胞傳代至10 cm培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，加800 μg/mL的G418篩選，每隔3-4 d換液一次。培養(yǎng)至細(xì)胞不再大批量死亡，且形成單克隆細(xì)胞團(tuán)后，挑單克隆于24孔板。對(duì)含有綠色熒光的單克隆細(xì)胞，收取細(xì)胞提基因組進(jìn)行PCR鑒定。根據(jù)pEGFP-mtDNA序列，分別設(shè)計(jì)3對(duì)引物P1（P1-F/P1-R）、P2（P2-F/P2-R）、P3（P3-F/P3-R）（表2），3對(duì)引物均可擴(kuò)增出目的條帶的細(xì)胞，則為陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株。

表2 常規(guī)PCR初篩陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株相關(guān)引物

1.2.2 絕對(duì)定量PCR檢測(cè)外源基因拷貝數(shù)

1.2.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)總體系20 μL（上/下游引物各0.5 μL、ddH2O 9 μL、2×SYBR premix Ex Taq 10 μL）。PCR反應(yīng)程序：95℃ 3 min；95℃ 15 S、60℃ 30 S（40個(gè)循環(huán)），熔解曲線60-95℃，每個(gè)樣品做3次重復(fù)。

1.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將pEGFP-mtDNA質(zhì)粒與HEK293細(xì)胞基因組DNA混合，設(shè)置分別含有1、2、4、8和16個(gè)外源基因拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照。具體方法如下：假設(shè)含有外源基因片段的質(zhì)粒大小為a bp，HEK293細(xì)胞基因組DNA用量為b ng，大小為3×109bp。外源基因片段完全隨機(jī)的頭尾相連的插入在一條染色體上，則b ng的基因組DNA中含有一個(gè)外源基因拷貝數(shù)的質(zhì)量為：a×b×0.5/3×109ng。設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增外源基因序列的引物對(duì)RT-F/RT-R，以β-actin為內(nèi)參的引物對(duì)Actin-F/Actin-R（表3）。將外源基因片段擴(kuò)增的CtpEGFP-mtDNA值減去內(nèi)參擴(kuò)增的CtActin值，得△Ct，再對(duì)樣品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值（以2為底）作圖得絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表3 絕對(duì)定量PCR檢測(cè)外源基因拷貝數(shù)相關(guān)引物

1.2.3 靶向目標(biāo)序列剪切活性檢測(cè) 構(gòu)建含有相應(yīng)mtDNA靶向目標(biāo)序列的CRISPR/Cas9質(zhì)粒。將該質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到所選陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株中。48-72 h后，收取細(xì)胞提基因組DNA，用1.2.1.2所述P1引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物送樣測(cè)序，測(cè)序引物為P1-R。如果靶向目標(biāo)序列在核基因組中發(fā)生DSBs，則會(huì)引發(fā)細(xì)胞中的NHEJ修復(fù)機(jī)制，得到插入或缺失突變。而對(duì)樣品全基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增所得的擴(kuò)增產(chǎn)物為混合產(chǎn)物，其中既含有野生型的原始靶向目標(biāo)序列，也含有引入插入或缺失的突變型靶向目標(biāo)序列。因此，使用Chromas軟件顯示測(cè)序峰圖，查看對(duì)應(yīng)靶向剪切位置處是否有套峰出現(xiàn)，如有套峰，則證明靶向目標(biāo)序列有剪切活性，反之則無(wú)。此外，還可根據(jù)套峰強(qiáng)弱判斷該系統(tǒng)對(duì)靶向目標(biāo)序列的剪切效率。

2 結(jié)果

2.1 獲得陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株

2.1.1 構(gòu)建pEGFP-mtDNA重組克隆質(zhì)粒 pEGFPN1為真核表達(dá)載體，含有EGFP基因和neo抗性基因。將一段含有兩個(gè)靶向目標(biāo)序列（T1、T2）的mtDNA序列，通過(guò)1.2.1.1所述方法與EGFP基因融合得到測(cè)序正確的重組克隆質(zhì)粒pEGFP-mtDNA（圖1）。該質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中，24 h后觀察EGFP表達(dá)情況，轉(zhuǎn)染效率達(dá)95%以上（圖2-A）。

2.1.2 初篩陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株 將鑒定正確的pEGFP-mtDNA重組克隆質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中（圖2-A），24 h后細(xì)胞傳代，并用G418篩選。當(dāng)有大批量未轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的細(xì)胞死亡后，及時(shí)換液。藥篩至細(xì)胞不再大量死亡，且形成單克隆細(xì)胞團(tuán)時(shí)，挑單克隆于24孔板中。對(duì)含有綠色熒光的11個(gè)單克隆細(xì)胞，收細(xì)胞提基因組。分別用3個(gè)引物對(duì)P1（P1-F/P1-R）、P2（P2-F/P2-R）、P3（P3-F/P3-R）對(duì)單克隆細(xì)胞所提基因組進(jìn)行PCR鑒定，3對(duì)引物均可擴(kuò)增出目的條帶的細(xì)胞，則為陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株，結(jié)果如圖2-B所示，單克隆細(xì)胞株2#、3#、5#、8#、10#為陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株。

2.2 檢測(cè)外源基因拷貝數(shù)

2.2.1 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線 將pEGFP-mtDNA質(zhì)粒與HEK293細(xì)胞基因組DNA混合，設(shè)置分別含有1、2、4、8和16個(gè)外源基因拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，用RTF/RT-R引物對(duì)擴(kuò)增外源基因片段，Actin-F/Actin-R引物對(duì)擴(kuò)增內(nèi)參β-actin，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次，取平均Ct值。其中，特異性引物對(duì)RT-F/RT-R的擴(kuò)增曲線、熔解曲線如圖3-A所示，內(nèi)參引物對(duì)Actin-F/Actin-R的擴(kuò)增曲線、熔解曲線如圖3-B所示，兩個(gè)熔解曲線均在86℃附近有且只有一個(gè)單峰，證明兩引物對(duì)均為特異性擴(kuò)增。將RT-F/RT-R擴(kuò)增的CtpEGFP-mtDNA減去Actin-F/Actin-R擴(kuò)增的CtActin，得△Ct?！鰿t與樣品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值（log2N）作圖得到標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3-C），Log2N= -1.177 2△Ct+2.779 3，決定系數(shù)R2=0.997 1。

2.2.2 檢測(cè)陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株的外源基因拷貝數(shù) 提取陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株2#、3#、5#、8#、10#基因組，并以此為模板做實(shí)時(shí)熒光定量PCR。將這5個(gè)細(xì)胞株的△Ct分別帶入計(jì)算公式：Log2N= -1.177 2△Ct+2.779 3，得其對(duì)應(yīng)的拷貝數(shù)（N），標(biāo)準(zhǔn)差在0.935 1和0.138 7之間，結(jié)果可信。具體拷貝數(shù)檢測(cè)結(jié)果如表4所示。

2.3 靶向目標(biāo)序列剪切活性檢測(cè)

構(gòu)建分別含有mtDNA靶向目標(biāo)序列T1、T2的兩個(gè)CRISPR/Cas9質(zhì)粒，命名為CRISPR/Cas9-T1、CRISPR/Cas9-T2。將CRISPR/Cas9-T1、CRISPR/Cas9-T2和相應(yīng)不含T1、T2靶向目標(biāo)序列的CRISPR/Cas9空骨架質(zhì)粒（Control-T1、Control-T2）分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到pEGFP-mtDNA陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株10#中。48 h后，收取細(xì)胞提基因組DNA，用1.2.1.2所述P1引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送樣測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，陰性對(duì)照Control-T1、Control-T2在靶向目標(biāo)序列處均無(wú)套峰出現(xiàn)（圖4-B），而作用質(zhì)粒CRISPR/Cas9-T1、CRISPR/Cas9-T2在靶向目標(biāo)序列處均有套峰出現(xiàn)，且CRISPR/Cas9-T1處的套峰強(qiáng)于CRISPR/Cas9-T2處（圖4-A）。

3 討論

基因組編輯技術(shù)，是研究相關(guān)基因功能的重要手段。作為三大基因組編輯技術(shù)之一的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，自2012年首次描述其對(duì)DNA的基本編輯能力后［17］，經(jīng)短短幾年發(fā)展，已取得豐碩研究成果。它不僅可以編輯DNA用于構(gòu)建癌癥模型［18］、清除人類(lèi)感染細(xì)胞中的HIV［19］、阻止杜氏營(yíng)養(yǎng)不良小鼠模型中的肌肉退化［20］等，還可以編輯RNA［21］，為更好的研究RNA功能提供了可能。目前的基因組編輯技術(shù)，大多只能改造核基因組，而很多人類(lèi)遺傳病是由于線粒體基因組突變所引起。mtDNA突變通常是異質(zhì)性的，只有當(dāng)mtDNA突變型占總mtDNA數(shù)量80%以上時(shí)，才會(huì)引起疾病癥狀［22］。在此之前，Minczuk和Bacman等［11-13］已分別將ZFN和TALEN兩種人工核酸酶用于清除人類(lèi)線粒體內(nèi)的突變型mtDNA，本實(shí)驗(yàn)室也基于人工CRISPR/Cas9系統(tǒng)獨(dú)特地構(gòu)建了作用于mtDNA的mtCRISPR/Cas9系統(tǒng)（結(jié)果未發(fā)表）。這3種經(jīng)改造后用于線粒體基因組編輯的線粒體核酸酶，同樣面臨著如何檢測(cè)靶向剪切活性的問(wèn)題。

圖2 陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株的篩選

對(duì)于核基因組編輯技術(shù)而言，由于核基因組中的DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)比較完整，可在DSBs處通過(guò)NHEJ修復(fù)引入插入或缺失突變。因此，其檢測(cè)方法主要有：（1）對(duì)靶向目標(biāo)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)變性、退火后形成錯(cuò)配，通過(guò)錯(cuò)配酶剪切不完全匹配的DNA序列，驗(yàn)證靶向目標(biāo)序列剪切活性；（2）對(duì)靶向目標(biāo)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，通過(guò)TA克隆測(cè)序與理論序列比對(duì)驗(yàn)證靶向目標(biāo)序列剪切活性；（3）對(duì)靶向目標(biāo)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)序，通過(guò)觀察靶位點(diǎn)處的套峰情況驗(yàn)證靶向目標(biāo)序列剪切活性。而線粒體對(duì)DNA的損傷修復(fù)能力較弱，無(wú)法通過(guò)上述方法檢測(cè)。本研究構(gòu)建了一個(gè)核基因組中含有單拷貝或低拷貝mtDNA靶向目標(biāo)序列的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，利用相應(yīng)核基因組編輯技術(shù)靶向剪切該細(xì)胞株的核基因組，通過(guò)上述第3種方法觀察靶向目標(biāo)序列測(cè)序峰圖鑒定剪切活性，該法簡(jiǎn)潔明了。

首先，在構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒時(shí)，可以如圖1-A所示，將一段含有一個(gè)或若干mtDNA靶向目標(biāo)序列的串聯(lián)序列連入克隆載體質(zhì)粒中，同時(shí)檢測(cè)多個(gè)靶向目標(biāo)序列的剪切活性。在外源基因與EGFP基因融合時(shí)要注意是否需調(diào)整編碼框、是否引入了起始密碼子或終止密碼子等問(wèn)題。其次，在篩選陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株時(shí)，通過(guò)設(shè)計(jì)的3對(duì)擴(kuò)增范圍涵蓋啟動(dòng)子區(qū)、編碼區(qū)、終止區(qū)的特異性引物對(duì)的同時(shí)鑒定，既保證了篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性，又確保了外源基因能夠完整表達(dá)。經(jīng)過(guò)藥物篩選得到的陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株，其外源基因往往隨機(jī)整合在染色體上。因此，在獲得陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株后，通過(guò)檢測(cè)其外源基因拷貝數(shù)，篩選單拷貝或低拷貝的陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株，是有效鑒定靶向目標(biāo)序列剪切活性的關(guān)鍵步驟。

目前，檢測(cè)外源基因拷貝數(shù)的方法主要有Southern blot法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。Southern blot法為傳統(tǒng)外源基因拷貝數(shù)檢測(cè)法，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法為近年來(lái)新興技術(shù)。通過(guò)比較，兩種方法在檢測(cè)外源基因拷貝數(shù)的準(zhǔn)確性上結(jié)果十分接近［23，24］。與Southern blot法相比，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法起始模板量小、靈敏性高、簡(jiǎn)單高效、成本較低、不需要進(jìn)行放射性實(shí)驗(yàn)［25，26］，該方法足以滿足本研究的篩選需要。在篩選得到的單拷貝或低拷貝陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株中，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染定量的人工核酸酶后，可通過(guò)測(cè)序峰圖鑒定靶向目標(biāo)序列剪切活性更加清晰，減少背景干擾。

此外，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法建立了檢測(cè)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株中外源基因拷貝數(shù)的實(shí)驗(yàn)體系。由于使用的SYBR Green I染料可廣泛嵌合在DNA雙鏈中，因此，引物的特異性尤為重要。設(shè)計(jì)引物時(shí)，盡量避免引物二聚體、引物發(fā)卡結(jié)構(gòu)等對(duì)結(jié)果的干擾，并通過(guò)熔解曲線鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物是否特異。如圖3-A、 3-B所示，本研究設(shè)計(jì)的內(nèi)參引物對(duì)與外源基因檢測(cè)引物對(duì)的擴(kuò)增曲線、熔解曲線均在86℃附近有且只有一個(gè)單峰，兩引物對(duì)均為特異性擴(kuò)增。且兩引物對(duì)的目的片段大小相近（分別為130 bp和127 bp），Tm值基本相等，擴(kuò)增效率基本相同。由于實(shí)時(shí)熒光定量PCR所需起始模板量小、檢測(cè)靈敏，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中每個(gè)樣品均做3個(gè)重復(fù)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以上措施更加保證了檢測(cè)結(jié)果的真實(shí)可信。

圖3 絕對(duì)定量PCR檢測(cè)外源基因拷貝數(shù)

表4 陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株的外源基因拷貝數(shù)檢測(cè)

圖4 T1、T2靶向目標(biāo)序列剪切活性檢測(cè)

當(dāng)然，驗(yàn)證mtDNA靶向目標(biāo)序列剪切活性的方法并不單一。如Bacman等［13］在酵母菌中利用單鏈復(fù)性（Single-strand annealing，SSA）［27］，檢測(cè)14459A-mitoTALEN的靶向剪切特異性。如發(fā)生特異性剪切，則促進(jìn)同源重組恢復(fù)Lac-Z基因功能，得到藍(lán)色菌落，反之為白色菌落。與本研究所構(gòu)建的含有靶向目標(biāo)序列的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系相比，雖檢測(cè)時(shí)間較短，但研究者可在構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒時(shí)，將多個(gè)靶向目標(biāo)序列或潛在發(fā)生非特異性剪切的序列串聯(lián)整合到核基因組中，靈活多變。一個(gè)細(xì)胞株不僅可以檢測(cè)多個(gè)靶向目標(biāo)序列的剪切活性、比較不同靶向目標(biāo)序列的剪切效率（圖4-A，T1、T2均具有靶向剪切活性，且T1剪切效率大于T2），還可以分析單堿基或多堿基不匹配下的潛在脫靶效應(yīng)等問(wèn)題，為更好的選擇靶向目標(biāo)序列、設(shè)計(jì)線粒體核酸酶提供了重要的參考依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，一舉多得。

4 結(jié)論

本研究利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將一段同時(shí)含有兩個(gè)靶向目標(biāo)序列（T1、T2）的mtDNA序列整合到宿主基因組中。通過(guò)3對(duì)擴(kuò)增不同位置的外源基因特異性引物對(duì)，篩選得到陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株后，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株中的外源基因拷貝數(shù)，挑選其中單拷貝或低拷貝的陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株。將含有相應(yīng)靶向目標(biāo)序列（T1、T2）的CRISPR/Cas9質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到所選細(xì)胞株中，驗(yàn)證T1、T2的靶向剪切活性的同時(shí)證明了該方法的可行性。建立了一種高效檢測(cè)線粒體核酸酶靶向剪切活性的新方法。

［1］ Perez EE， Wang J， Miller JC， et al. Establishment of HIV-1 resistance in CD4+T cells by genome editing using zinc-finger nucleases［J］. Nature Biotechnology， 2008， 26（7）：808-816.

［2］ Urnov FD， Miller JC， Lee YL， et al. Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases［J］. Nature， 2005， 435（7042）：646-651.

［3］ Baker M. Gene-editing nucleases［J］. Nature Methods， 2012， 9（1）：23-26.

［4］ Sternberg SH， Redding S， Jinek M， et al. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9［J］. Nature， 2014， 507（7490）：62-67.

［5］ Doudna JA， Charpentier E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9［J］. Science， 2014， 346（6213）：1258096.

［6］ Pozzan T， Magalhaes P， Rizzuto R. The comeback of mitochondria to calcium signalling［J］. Cell Calcium， 2000， 28（5-6）：279-283.

［7］ Starkov AA. The role of mitochondria in reactive oxygen species metabolism and signaling［J］. Annals of the New York Academy of Sciences， 2008， 1147：37-1152.

［8］ Anderson S， Bankier AT， Barrell BG， et al. Sequence and organization of the human mitochondrial genome［J］. Nature，1981， 290（5806）：457-465.

［9］ Schapira AH. Mitochondrial disease［J］. Lancet， 2006， 368（9529）：70-82.

［10］ Obara-Moszynska M， Maceluch J， Bobkowski W， et al. A novel mitochondrial DNA deletion in a patient with Kearns-Sayre syndrome：a late-onset of the fatal cardiac conduction deficit and cardiomyopathy accompanying long-term rGH treatment［J］. BMC Pediatrics， 2013， 13：27.

［11］ Minczuk M， Papworth MA， Kolasinska P， et al. Sequence-specific modification of mitochondrial DNA using a chimeric zinc finger methylase［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2006， 103（52）：19689-19694.

［12］ Minczuk M， Papworth MA， Miller JC， et al. Development of a single-chain， quasi-dimeric zinc-finger nuclease for the selective degradation of mutated human mitochondrial DNA［J］. Nucleic Acids Research， 2008， 36（12）：3926-3938.

［13］ Bacman SR， Williams SL， Pinto M， et al. Specific elimination of mutant mitochondrial genomes in patient-derived cells by mitoTALENs［J］. Nature Medicine， 2013， 19（9）：1111-1113.

［14］ Croteau DL， Stierum RH， Bohr VA. Mitochondrial DNA repair pathways［J］. Mutation Research， 1999， 434（3）：137-148.

［15］ Liu P， Demple B. DNA repair in mammalian mitochondria：Much more than we thought？［J］. Environmental and Molecular Mutagenesis， 2010， 51（5）：417-426.

［16］ Boesch P， Weber-Lotfi F， Ibrahim N， et al. DNA repair in organelles：Pathways， organization， regulation， relevance in disease and aging［J］. Biochim Biophys Acta， 2011， 1813（1）：186-200.

［17］ Jinek M， Chylinski K， Fonfara I， et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity［J］. Science， 2012， 337（6096）：816-821.

［18］ Xue W， Chen S， Yin H， et al. CRISPR-mediated direct mutation of cancer genes in the mouse liver［J］. Nature， 2014， 514（7522）：380-384.

［19］ Hu W， Kaminski R， Yang F， et al. RNA-directed gene editing specifically eradicates latent and prevents new HIV-1 infection［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2014， 111（31）：11461-11466.

［20］ Long C， McAnally JR， Shelton JM， et al. Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA［J］. Science， 2014， 345（6201）：1184-1188.

［21］ O’Connell MR， Oakes BL， Sternberg SH， et al. Programmable RNA recognition and cleavage by CRISPR/Cas9［J］. Nature，2014， 516（7530）：263-266.

［22］ Schon EA， DiMauro S， Hirano M. Human mitochondrial DNA：roles of inherited and somatic mutations［J］. Nature Reviews Genetics， 2012， 13（12）：878-890.

［23］ Yang L， Ding J， Zhang C， et al. Estimating the copy number of transgenes in transformed rice by real-time quantitative PCR［J］. Plant Cell Reports， 2005， 23（10-11）：759-763.

［24］ Ingham DJ， Beer S， Money S， et al. Quantitative real-time PCR assay for determining transgene copy number in transformed plants［J］. Biotechniques， 2001， 31（1）：132-134， 6-40.

［25］ Song P， Cai C， Skokut M， et al. Quantitative real-time PCR as a screening tool for estimating transgene copy number in WHISKERSTM-derived transgenic maize［J］， Plant Cell Reports，2002， 20（10）：948-954.

［26］ 王曉建， 楊旭， 宋曉東， 等. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠拷貝數(shù)［J］. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)， 2007（3）：170-174.

［27］ Liddell L， Manthey G， Pannunzio N， et al. Quantitation and analysis of the formation of HO-endonuclease stimulated chromosomal translocations by single-strand annealing in Saccharomyces cerevisiae［J］. Journal of Visualized Experiments， 2011（55）：e3150.

（責(zé)任編輯 狄艷紅）

A Novel Method for Detecting Activity of Mitochondria-targeted Nuclease

Wei Di1，2Gao Jing1，2Chi Zhenfen3Zhang Guirong1，2Nie Lingyun1，2
（1. Hebei North University，Zhangjiakou 075000；2. Institute for Drug and Instrument Control，Health Department，the General Logistics Department of People’s Liberation Army，Beijing 100071；3. Beijing Institute of Genomics，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100101）

Mitochondrial DNA（mtDNA）mutation has been associated with human mitochondrial disease. The precise correction of mutated mtDNA is considered an important strategy of mitochondrial therapy. Due to the lack of the complete repair system of DNA damage，a convenient method for detecting activity of mitochondria-targeted nuclease needs to be innovated urgently. Using transgenic technology， a mitochondrial DNA containing two target sequences（T1 and T2）was integrated into host genome randomly. Single or low copy monoclonal transgenic cell lines were selected by real-time fluorescence quantitative PCR. The two CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）/Cas9 plasmids， which contained T1 and T2 target sequences， were transiently transfected into selected copy monoclonal transgenic cell lines. Target DNA double-strand breaks were caused by CRISPR/Cas9， followed by DNA insertion and deletion mutation via non-homologous end joining repair pathway. The cutting activities of two target sequences were proved by DNA sequencing peaks diagram， it was proved that two target sequences of T1 and T2 had the cutting activity， furthermore， T1 was better than T2. A novel method for rapidly and efficiently detecting activity of mitochondria-targeted nuclease is established.

mitochondria-targeted nuclease；transgenic cell line；targeted modification；CRISPR/Cas9；real-time fluorescence quantitative PCR

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.012

2015-03-18

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31371346）

魏迪，女，碩士研究生，研究方向：遺傳學(xué)研究新技術(shù)與新方法；E-mail：18311012326@163.com

聶凌云，女，博士，研究方向：遺傳學(xué)研究新技術(shù)與新方法；E-mail：nielingyun@126.com