基于HUVEC細(xì)胞表面ELAM-1表達(dá)的抗TNF-α抗體活性檢測方法

陳坤 徐軍 謝燦 周冬梅 楊彬 孫文正

（廣東東陽光藥業(yè)有限公司，東莞 523867）

基于HUVEC細(xì)胞表面ELAM-1表達(dá)的抗TNF-α抗體活性檢測方法

陳坤 徐軍 謝燦 周冬梅 楊彬 孫文正

（廣東東陽光藥業(yè)有限公司，東莞 523867）

旨在建立抗TNF-α單克隆抗體生物學(xué)活性測定的方法。腫瘤壞死因子TNF-α能刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC表達(dá)黏附分子ELAM-1，通過抗TNF-α抗體中和TNF-α來抑制這種表達(dá)，從而建立該抗體的生物學(xué)活性檢測方法，并進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，建立抗體活性檢測方法，驗(yàn)證方法的特異性較好、回收率為92.1%-102.1%，方法重復(fù)12次，RSD為7.66%。在50%-150%的線性良好，相關(guān)系數(shù)為0.99。該活性檢測方法適于抗體體外活性的檢測。

單克隆抗體；HUVEC細(xì)胞；ELAM-1；腫瘤壞死因子TNF-α

腫瘤壞死因子（Tumour necrosis factor，TNF），又叫惡病質(zhì)因子（Cachectin）［1］。TNF按其結(jié)構(gòu)分兩型：TNF-α和TNF-β。TNF-α參與的多種致病機(jī)制，包括內(nèi)皮細(xì)胞的激活、細(xì)胞因子的誘導(dǎo)、白細(xì)胞的聚集、破骨細(xì)胞的活化與軟骨的破壞等［2］導(dǎo)致炎癥反應(yīng)持續(xù)發(fā)生、軟骨與骨的漸進(jìn)性破壞［2-4］。黏附分子是一類介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間或細(xì)胞與基質(zhì)間相互作用的分子。白細(xì)胞表面黏附分子（E-Selectin）、白細(xì)胞細(xì)胞間黏附分子-1（Intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）和血管細(xì)胞黏附分子-1（Vascular celladhesion molecule-1，VCAM-1）屬于免疫球蛋白超家族成員。研究認(rèn)為，VCAM-1和ICAM-1在介導(dǎo)的炎癥發(fā)生過程中起到了極其重要的作用［5，6］，其中在病變形成早期和進(jìn)展期，黏附分子促進(jìn)內(nèi)皮黏附、遷移并與其他細(xì)胞作用，在整個(gè)病變過程中起到了關(guān)鍵性的作用［7.8］。

近些年來，針對TNF-α的藥物研究倍受關(guān)注，其中中和TNF-α的抗體生物藥成為研究熱點(diǎn)。生物藥結(jié)構(gòu)復(fù)雜，理化分析不能完全詮釋它的功能與活性，所以在研究生產(chǎn)中，建立簡單準(zhǔn)確的活性分析方法十分必要。針對TNF-α抗體的常用活性分析方法為TNF-α誘導(dǎo)L929細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，鑒于單抗生物藥的特殊性，單一檢測方法不夠科學(xué)，采用多種體外活性試驗(yàn)方法評價(jià)生物藥的生物活性顯得越來越重要。雖然，國內(nèi)外有不少文獻(xiàn)資料［5-10］報(bào)道可以用HUVEC細(xì)胞檢測抗TNF-α抗體活性，但還沒有文章對該檢測方法有詳細(xì)、系統(tǒng)的描述。本研究采用TNF-α刺激HUVEC細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞黏附因子（ELAM-1），通過抗體抑制細(xì)胞表面ELAM-1的表達(dá)，建立抗TNF-α抗體的活性檢測方法，對其進(jìn)行系統(tǒng)驗(yàn)證，以期研究該方法的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 抗TNF-α 單克隆抗體（美國雅培）、HUVEC細(xì)胞（ATCC CRL-1730）、F-12K培養(yǎng)液（GIBCO 21127022）、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、吐溫-20和肝素均來自SIGMA；胎牛血清、青霉素和鏈霉素溶液、胰蛋白酶溶液、DPBS溶液均采自HYCLONE；TNF-α凍干粉（GIBCO PHC3011）、戊二醛、鼠抗人ELAM-1和HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG采自Abcam公司；TMB反應(yīng)液（AB000802）來自廣州怡雅；PBS粉末來自博士德。

1.1.2 儀器 超凈工作臺(tái)（蘇凈安泰）、倒置顯微鏡（OLYMPUS IX71）、二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo 150i）、酶標(biāo)儀（Molecular Devices MD M2E）、洗板機(jī)（Thermo）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞Elisa法檢測ELAM-1的方法建立 取對數(shù)生長期的HUVEC細(xì)胞，消化重懸計(jì)數(shù)并種植于96孔板中，100 μL/孔，每孔2 500個(gè)細(xì)胞，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培育貼壁。加TNF-α溶液，200 μL/孔，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育刺激，加戊二醛溶液固定細(xì)胞；PBS洗板后，加入3%BSA 37℃封閉；PBS洗板3次，加稀釋的鼠抗人ELAM-1單抗（一抗）50 μL/孔，37℃孵育；PBST洗板3次，加稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（二抗），每孔100 μL，37℃孵育；PBST洗板3次，加TMB溶液100 μL/孔，37℃顯色；最后用1 mol/L硫酸終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀450 nm讀取光密度值。

1.2.2 TNF-α刺激細(xì)胞濃度摸索實(shí)驗(yàn) 將TNF-α干粉溶于1 mL全培養(yǎng)液中，配制90 ng/mL的TNF-α溶液。將上述的TNF-α溶液進(jìn)行梯度倍比稀釋，得系列濃度的TNF-α溶液：0.35、0.70、1.40、2.81、5.62、11.25、22.50、45.00和90.00 ng/mL，各濃度設(shè)定3個(gè)復(fù)孔，設(shè)置細(xì)胞陰性對照孔，細(xì)胞Elisa法檢測ELAM-1的表達(dá)量。

1.2.3 抗TNF-α抗體活性測定方法建立 用一定濃度TNF-α和系列濃度抗體的混合溶液共同孵育貼壁后的HUVEC細(xì)胞，200 μL/孔?？贵w標(biāo)準(zhǔn)溶液為640 ng/mL，將其倍比稀釋，濃度范圍為：2.5、5、10、20、40、80、160、320和640 ng/mL。設(shè)置細(xì)胞對照、TNF-α陽性對照、抗體對照及空白對照。各濃度均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，依照1.2.1步驟通過細(xì)胞Elisa法檢測450 nm處的光密度值。數(shù)值以四參數(shù)擬合回歸方程Y=（A-D）/［1+（x/C）B］+D計(jì)算抗體與ELAM-1之間的劑量關(guān)系，得出抗體的生物學(xué)活性IC50值。

1.2.4 抗TNF-α抗體活性測定的驗(yàn)證

1.2.4.1 方法特異性 分別配制系列濃度抗TNF-α抗體標(biāo)準(zhǔn)溶液和非抗TNF-α抗體樣品溶液，并將抗TNF-α抗體70℃高溫變性處理5 min、30 min、60 min。分別按1.2.3方法檢測各條件下溶液的IC50值。

1.2.4.2 線性及準(zhǔn)確度 配制濃度為320 ng/mL（50%）、480 ng/mL（75%）、640 ng/mL（100%）、800 ng/mL（125%）、960 ng/mL（150%）的抗TNF-α抗體溶液，再按1.2.3實(shí)驗(yàn)方法分別倍比稀釋并檢測ELAM-1的值。每濃度水平溶液平行測定3條曲線，并將理論水平相對實(shí)際水平作直線擬合，得出線性方程。

1.2.4.3 精密度和中間精密度 平行配制6份640 ng/mL的抗TNF-α抗體標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2.3的抗體檢測方法檢測各份溶液的IC50值，計(jì)算得出抗體的活性。按抗體檢測IC50與100%濃度抗體IC50比值得出相對活性。另一實(shí)驗(yàn)人員同樣平行配制6份抗TNF-α抗體標(biāo)準(zhǔn)溶液，檢測各份的IC50值，并同樣計(jì)算出相對活性值。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞Elisa法檢測ELAM-1方法建立

逐一摸索細(xì)胞Elisa法檢測ELAM-1的條件：細(xì)胞種植密度2 500 個(gè)/孔，細(xì)胞培育24 h貼壁后進(jìn)入對數(shù)期。由表1可知，5 h時(shí)ELAM-1表達(dá)量基本穩(wěn)定，此時(shí)信噪比最佳，故選擇TNF-α孵育時(shí)間為5 h。1%戊二醛固定30 min、3%BSA封閉1 h，一抗、二抗最佳稀釋比例分別為1∶1 500、1∶4 000（圖1），孵育時(shí)間依次為2 h和1 h，TMB顯色20 min，測定450 nm的光密度值。

表1 TNFα不同孵育時(shí)間的ELAM-1檢測結(jié)果

圖1 細(xì)胞Elisa實(shí)驗(yàn)一抗（A）和二抗的稀釋優(yōu)化實(shí)驗(yàn)（B）

2.2 TNF-α對HUVEC細(xì)胞刺激濃度的確定

根據(jù)1.2.2實(shí)驗(yàn)摸索TNF-α的刺激濃度，結(jié)果如圖2所示，隨著TNF-α溶液濃度加大，細(xì)胞表面ELAM-1的表達(dá)量也呈現(xiàn)明顯增大。當(dāng)其濃度達(dá)到22.5 ng/mL時(shí)，ELAM-1的量基本達(dá)到平臺(tái)，表明此條件下細(xì)胞表達(dá)達(dá)到飽和，因此在隨后的實(shí)驗(yàn)中TNF-α刺激濃度被選擇為22.5 ng/mL。

圖2 不同濃度的TNF-α刺激細(xì)胞的ELAM-1表達(dá)

2.3 抗TNF-a抗體中和活性實(shí)驗(yàn)建立

根據(jù)2.1、2.2的結(jié)果，確定了TNF-α濃度及刺激孵育細(xì)胞的時(shí)間，同時(shí)也確定了一抗、二抗的稀釋比例，由此建立了檢測ELAM-1的實(shí)驗(yàn)方法。選擇抗體初始濃度為640 ng/mL，以3倍稀釋使終濃度為：2.5、5、10、20、40、80、160、320和640 ng/mL，檢測結(jié)果（圖3）表明ELAM-1表達(dá)量與抗體濃度呈現(xiàn)一定的劑量關(guān)系。報(bào)告檢測結(jié)果的絕對IC50值（38.5 ng/mL）體現(xiàn)抗體對TNF-α中和效力。

圖3 細(xì)胞Elisa法檢測抗體活性的劑效曲線

2.4 抗體生物學(xué)活性方法驗(yàn)證

2.4.1 方法專屬性驗(yàn)證 方法的專屬性結(jié)果（表2）表明，此方法只針對抗TNF-α抗體的活性檢測，對于非抗TNF-α抗體（陰性對照品為貝伐單抗）在TNF-α對照和貝伐抗體對照的孔中，OD值沒有任何變化，其結(jié)果曲線圖也無明顯劑效關(guān)系。此外，我們考察了高溫破壞對于該類抗體活性的影響，如表2所示抗體在70℃的高溫下，時(shí)間越久，活性降低越多，當(dāng)加熱時(shí)間增至30 min時(shí)，抗體幾乎完全聚合變性而失活。

表2 抗體活性檢測專屬性

2.4.2 方法線性測定 如表3所示，實(shí)際水平即測定的相對活性，理論水平即配制濃度的相對比例。將5個(gè)實(shí)際水平平均值對理論水平做直線擬合，該方法在50%-150%之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。線性擬合方程為y=1.054 6x-0.076 2，R2=0.992 5。

圖3 抗體活性檢測線性曲線

表3 抗體活性檢測之準(zhǔn)確度

2.4.3 抗體活性方法準(zhǔn)確度檢測 將各濃度水平50%、75%、100%、125%和150%平行測定3條曲線，根據(jù)吸光度均值和對應(yīng)濃度進(jìn)行四參數(shù)擬合得到生物活性的實(shí)驗(yàn)測得值、理論值并計(jì)算回收率。單個(gè)回收率在81%-110%之間，而15個(gè)檢測結(jié)果的平均回收率為96.76%。所有結(jié)果的95%置信區(qū)間在92%-101%。

2.4.4 抗體活性檢測方法精密度檢測 平行配制6份抗TNF-α抗體溶液，按抗體活性檢測方法測吸光度值并計(jì)算IC50值，得出生物活性（表4）。結(jié)果表明，6次平行的RSD%為9.25%。另一實(shí)驗(yàn)員同樣方法另行配制檢測6份抗體溶液，得出生物活性，12份的RSD為7.66%。

表4 抗體活性檢測精密度結(jié)果

3 討論

該實(shí)驗(yàn)方法在國內(nèi)外關(guān)于HUVEC細(xì)胞表面粘附分子研究的基礎(chǔ)上，利用抗TNF-a抗體可以抑制TNF-a刺激HUVEC細(xì)胞表達(dá)ELAM-1來檢測抗體的生物學(xué)活性。該方法的建立基于Thorne等首次闡明細(xì)胞因子（TNF-a和IL-1β）增加單核細(xì)胞-冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞黏附是通過ELAM-1、VCAM-1和ICAM-1機(jī)制?？筎NF-α藥物抑制介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表面粘附分子的表達(dá)是控制細(xì)胞在血管壁積聚的關(guān)鍵調(diào)控點(diǎn)［5，10］。相比常規(guī)的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，該法結(jié)合了酶聯(lián)免疫的高度靈敏性及準(zhǔn)確性特點(diǎn)，為實(shí)驗(yàn)提供了更準(zhǔn)確的結(jié)果。

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC經(jīng)TNF-α處理后，細(xì)胞表面ELAM-1的表達(dá)有明顯增高，且細(xì)胞在孵育5 h時(shí)ELAM-1表達(dá)量達(dá)到穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在正常生長條件下也會(huì)表達(dá)該黏附分子，只是量比較少，這一發(fā)現(xiàn)也與文獻(xiàn)報(bào)道相符。對于細(xì)胞表達(dá)ELAM-1因子的檢測，采用Elisa法，本實(shí)驗(yàn)一抗的選擇在于保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性，信噪比更高的情況下方法更穩(wěn)定，故以1∶1 500稀釋一抗。實(shí)驗(yàn)中二抗則以1∶4 000稀釋比例得到最佳的劑量曲線。

在專屬性實(shí)驗(yàn)中，抗體經(jīng)高溫破壞，活性明顯降低。猜測與抗體在高溫下迅速聚合有關(guān)，經(jīng)SEC（分子排阻色譜柱）分析實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)70℃處理超過5 min或更長時(shí)間時(shí)，抗體多聚體含量顯著提高，這與推測相符。由此說明，多聚體的產(chǎn)生對生物抗體藥物的活性會(huì)有明顯的影響。在方法準(zhǔn)確度及線性實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證中，我們發(fā)現(xiàn)抗體濃度為50%時(shí)，單個(gè)點(diǎn)的回收率低于平均回收率，這可能與該法的缺陷有關(guān)，當(dāng)抗體活性接近50%，即到達(dá)線性的最低點(diǎn)時(shí)，結(jié)果呈現(xiàn)不穩(wěn)定性。由ELAM-1因子的表達(dá)檢測抗體活性，我們嘗試以一定濃度TNF-α作用細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)黏附分子ICAM-1、VCAM-1均有一定量的表達(dá)，而且，它們在孵育相同時(shí)間時(shí)，各自的表達(dá)量有一定的差別，據(jù)此方法條件摸索出各因子最佳表達(dá)時(shí)間，并對其分別檢測即可達(dá)到檢測抗體活性的更多方法。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)室通過建立細(xì)胞-酶聯(lián)免疫法檢測抗TNF-a抗體的活性，克服了常規(guī)單一方法檢測活性的局限性，開拓了該類抗體體外活性檢測的新思路。通過對該法進(jìn)行完整的驗(yàn)證，表明該法檢測抗體活性具有一定的科學(xué)性、準(zhǔn)確性更能反映抗體活性的真實(shí)性。此外，該方法的建立也為通過其他兩個(gè)因子（ICAM-1和VCAM-1）檢測抗體活性提供了思路，可以依此建立更全面反映藥物體外活性的檢測手段，保證藥物研發(fā)生產(chǎn)中更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

A Method for the Activity Assay of Anti-TNF-α Antibodies Expressed by ELAM-1 in HUVEC Surface

Chen Kun Xu Jun Xie Can Zhou Dongmei Yang Bin Suen Wenzheng
（Sunshine Lake Pharma Co.，Ltd，Dongguan 523867）

This study is to develop a method to assay the biologic activity of anti-TNF-α（tumor necrosis factor-alpha）monoclonal antibodies. TNF-α stimulates the expression of adhesion molecules E-Selectin（ELAM-1）in human umbilical vein endothelial cells（HUVEC），whereas anti-TNF-αantibodies suppress the expression of ELAM-1 in HUVEC cells through neutralizing TNF-α. Based on this principle，we developed and validated a method for the bioactivity assay of the antibodies. The result showed that the assay method was established successfully， and the specificity of the method was validated to be feasible. The recovery rate was 92.1%-102.1%， and the RSD was ≦ 7.66% while repeated 12 times. The linear range in 50% to 150% was fine， and the correlation coefficient was 0.99. Conclusively， this method is well suited as an activity assay of antibodies in vitro.

monoclonal antibody；HUVEC cell；ELAM-1；TNF-α

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.010

2015-04-20

廣東省引進(jìn)創(chuàng)新科研團(tuán)隊(duì)計(jì)劃資助（201101Y0104990178）

陳坤，女，碩士研究生；研究方向：單抗生物藥研發(fā)；E-mail：chenkun@hecpharm.com

楊彬，男，碩士研究生，職稱：研究方向：生物制藥，單抗生物藥研發(fā)；E-mail：yangbin@hecpharm.com