rAAV規模化包裝系統的研究進展

占申標 唐明青 甘娜 曹苑青 李招發

（華僑大學生物醫學學院，泉州 362021）

rAAV規模化包裝系統的研究進展

占申標 唐明青 甘娜 曹苑青 李招發

（華僑大學生物醫學學院，泉州 362021）

重組腺相關病毒（rAAV）作為唯一一種通過歐盟FDA認證的基因治療載體，具有宿主范圍廣、轉染效率高、非致病性、免疫原性低、能夠長期表達外源基因的優點。隨著以rAAV基因治療臨床試驗的深入與擴大，傳統rAAV包裝系統產能不足的缺點逐漸凸顯出來，急需可放大、易規模化的rAAV包裝系統來解決現有的供需矛盾。鑒于此，在介紹傳統rAAV包裝系統的基礎之上，著重闡述了桿狀病毒昆蟲細胞系法、酵母法以及痘苗病毒-腺病毒法，尤其對后者寄予厚望。旨在介紹幾種較好的rAAV規模化包裝方案，探討其規模化制備的發展趨勢。

重組腺相關病毒；基因治療；載體；包裝系統

腺相關病毒（Adeno-associated virus，AAV）為復制缺陷型病毒，屬細小病毒家族，至今還沒有發現與人類的任何疾病相關，其能定點整合到人類基因組19號染色體上［1］。另外，AAV還有免疫原性弱、宿主范圍廣、理化性質穩定、長期表達外源基因等優點［2-4］，因此AAV被認為是介導基因治療的理想載體之一。重組腺相關病毒載體（rAAV）源于非致病的野生型AAV，在醫學研究中，rAAV被用于多種疾病的基因治療的研究（包括體內、體外）；同時作為一種有特點的基因轉移載體，還廣泛用于基因功能研究、構建疾病模型、制備基因敲除鼠等方面。目前有關以rAAV為載體的基因治療臨床研究報道已經超過90多項［4］。

作為基因載體，rAAV進一步從實驗室走向臨床應用的一個關鍵性問題是如何規模化制備經濟、安全、質量可控的rAAV載體，文章旨在介紹幾種新型規模化生產rAAV的方法，探討基因治療中rAAV載體規模化制備的發展趨勢。

1 rAAV制備的兩個重要過程

1.1 rAAV衣殼蛋白的裝配

1.1.1 rAAV的包裝原件 AAV基因組為約4.7 kb的單鏈DNA，兩個末端是倒轉重復序列（ITR），是AAV整合、復制、拯救和包裝所必須的順式作用元件，并具轉錄啟動子活性。ITR序列之間包含兩個開放閱讀框，稱為Rep和Cap，分別編碼4個Rep蛋白（Rep78、Rep68、Rep52和Rep40）和3個Cap蛋白（VP1、VP2和VP3）以及1個最近幾年才發現的裝配激活蛋白（AAP）（圖1）［5，6］，這幾種蛋白均在rAAV的包裝過程中扮演極其重要的角色。其中Rep78和Rep68的轉錄由p5啟動子控制，Rep52和Rep40由p19啟動子起始轉錄，p40啟動子調節Cap蛋白VP1、VP2和VP3的轉錄［7］。

圖1 AAV基因組結構

1.1.2 rAAV病毒樣粒子的裝配 研究稱在細胞內，rAAV病毒樣粒子的裝配只需Cap基因表達即可完成，且裝配在細胞核內進行［8］。傳統觀點認為，Cap基因只編碼VP1、VP2和VP3三種蛋白，但是病毒樣粒子的形成究竟是需要三種蛋白、兩種蛋白還是一種蛋白，一直存在爭論。VP1和VP2主要定位于細胞核內，而單體的VP3在核內和細胞質內均有分布，表明VP1、VP2和VP3在裝配過程中具有不同的行為。VP1和VP2上都具有核定位信號（166PARKRLNF173），可能起到運送VP3進入細胞核的作用［9］。因為衣殼表面全部由VP3序列（包括VP3、VP1和VP2的C末端）組成，VP1和VP2的N末端位于衣殼的內部，因此爭論的焦點主要是VP3單獨能否組裝出rAAV病毒樣粒子。

最初Ruffing等［10］在HeLa細胞中利用質粒單獨表達VP3并不能形成rAAV病毒樣粒子，但如果將VP3與VP1或VP2共表達，則可見rAAV病毒樣粒子形成；利用桿狀病毒載體在昆蟲細胞系sf9表達VPs的研究表明，VP3單獨表達也不能形成rAAV病毒樣粒子。然而Warrington等［11］發現，在293細胞中單獨表達VP3能產生rAAV病毒樣粒子。針對這一貌似矛盾的結論，Sonntag等［5］展開研究，發現Cap基因還編碼另外一種蛋白AAP，其編碼框介于VP2和VP3之間。該研究顯示，VP3單獨不能形成rAAV病毒樣粒子，但是如果與表達AAP的質粒共轉染，則能形成rAAV病毒樣粒子［11］。在Ruffing的研究中，VP3表達質粒只包含VP3序列本身，不能表達AAP，正是這一質粒構建上的差別導致其與Warrington實驗結果不一致。AAP主要定位于細胞核內，協助VPs蛋白從細胞質進入細胞核，起到病毒裝配的支架作用，還可能協助VPs進行正確折疊。1.1.3 其他因素在rAAV病毒樣粒子裝配中的作用 除了AAP之外，在細胞核內，可能還有其他因子協助完成rAAV衣殼的裝配，包括Rep蛋白、核仁磷蛋白等。

rAAV病毒樣粒子在細胞核內裝配時，衣殼蛋白分子并非獨立存在，而是與Rep蛋白發生交聯。在rAAV制備過程中，這一交聯比較容易受到破壞，故在目前制備的rAAV中檢測不到Rep蛋白，但是這并不能否認Rep蛋白在rAAV病毒樣粒子形成中的作用［12］。

rAAV感染后完整衣殼最初呈現于核仁中，隨后遍及整個細胞核，表明核仁的某些成分在衣殼蛋白裝配過程中起到重要作用。研究發現，利用siRNA干擾核仁磷蛋白，rAAV載體的基因表達效率可以提高5-15倍，表明核仁磷蛋白確實與rAAV在核內的行為存在聯系［13］。另有研究表明，核仁磷蛋白可與衣殼之間存在直接的連接，而且核仁磷蛋白還具有與Rep結合的能力［14］。

除了某些蛋白成分可能影響衣殼裝配外，細胞本身的環境因素也可能對rAAV病毒樣粒子的裝配起到至關重要的作用，如ATP、溫度等。

1.2 DNA的衣殼化

rAAV衣殼蛋白的裝配和DNA的衣殼化是rAAV包裝過程中兩個最為重要的過程。這兩個過程目前有了總體上的認識，雖然許多細節還無法知曉，尤其是基因組進入衣殼的過程還知之甚少。現有的rAAV包裝機制模型達成了以下基本共識：先是Rep蛋白連接單鏈DNA（ssDNA）的ITR以及Cap蛋白，將ssDNA定位于衣殼表面，接下來ssDNA借助于Rep蛋白的螺旋酶活性和ATPase活性，以3'-5'為方向，在衣殼五倍軸的頂端小孔進入衣殼。其中，ssDNA導入已經形成的病毒衣殼的具體機制還未研究清楚［15］（圖2）。

圖2 AAV衣殼以及五倍軸小孔的結構

2 rAAV的經典包裝系統

從rAAV被用作基因載體開始，研究者就在嘗試各種高效制備rAAV的方法，以達到方便、靈活、規模化制備能滿足科研研究和臨床所需rAAV的目的。目前應用最廣的是三質粒共轉染HEK293細胞法獲得rAAV。三質粒轉染法即將一個提供外源基因和ITR的質粒、一個提供rAAV輔助功能的質粒、一個提供腺病毒輔助功能的質粒共轉染宿主HEK293細胞。三質粒轉染法最大的優點是不用加輔助病毒，排除了輔助病毒對rAAV的污染，方便制備各種血清型的rAAV，使制備和純化步驟大為簡化，制備的rAAV基本可以滿足實驗室研究所用。

3 rAAV的新型包裝系統

3.1 利用桿狀病毒昆蟲細胞系sf9來表達rAAV

近些年來，桿狀病毒昆蟲表達系統在蛋白質表達和病毒制備等方面發揮重要的作用，特別是Bacto-Bac系統大大簡化了桿狀病毒的制備過程。陳雅寧等［17］設想利用桿狀病毒昆蟲表達系統制備rAAV，克服傳統方法中的諸多限制因素，滿足臨床級別rAAV的要求。將rAAV的ITR及目的基因表達框從pAAV-MCS剪切引入桿狀病毒載體中構建順式載體，rAAV的衣殼和復制蛋白基因在反式pFastBacDual中利用真核基因遺漏掃描原理表達，兩者分別制備成桿狀病毒，共感染昆蟲細胞sf9來完成rAAV拯救、復制和包裝過程。病毒滴度可達1×108-3×108VG/mL。增強綠色熒光蛋白（EGFP）作為報告基因驗證其可行性，將生產的rAAV-EGFP感染293T細胞測試得知其具有良好的生物學活性，該系統具有高效、安全、簡便等特點，為臨床級rAAV制備和基因治療奠定了基礎。

另外，Urabe等［18］建立的昆蟲桿狀病毒系統，避免了質粒轉染人類細胞效率低的問題，這種方法需要3種桿狀病毒，rBac-Rep、rBac-Cap、rBac-ITRGFP-ITR分別提供Rep、Cap、ITR和目的基因，先在sf9細胞中擴增3種桿狀病毒，然后將純化的桿狀病毒共感染懸浮培養的sf9細胞，就可以大規模制備rAAV。病毒感染法無需瞬時轉染，也不需要建立穩定轉染的細胞系，所有元件都由病毒提供。此法優點主要有：桿狀病毒感染細胞后產生的子代病毒可以繼續感染細胞，大大提高了制備效率；可以在制備過程中對各種參數進行監測和控制；避免了瞬時轉染貼壁細胞這一限制性步驟；容易大規模培養；制備成本低［19］。但桿狀病毒缺乏遺傳學和物理學穩定性是此系統目前面臨的最大挑戰。

3.2 利用痘苗病毒規模化和安全化制備rAAV載體

盡管最近幾年以rAAV為載體基因治療的臨床研究比較成功，但是大規模化和高效的生產高質量的rAAV依然面臨不少難題。Dong等［20］采用能在細胞質完成生命周期的痘苗病毒（VV）作為rAAV輔助元件Rep-Cap的表達載體，以腺病毒-腺相關病毒（Ad-AAV）雜合載體作為rAAV載體基因組和輔助病毒基因組的提供者。這樣就使rAAV輔助基因位于細胞質內，而rAAV DNA能夠整合到宿主的細胞核中，它們便處于兩個不同的亞細胞部位，從空間上避免了普遍存在的非同源重組的發生，使得野生型有復制能力AAV（rcAAV）的污染得以首次徹底消除（圖3）。在懸浮的HeLa細胞中，每個細胞獲得的rAAV載體產量接近于傳統的三質粒共轉染所得。由于當今分析條件的限制，很難有效發現rcAAV的污染，這種新的方法有效的解決了這一難題，無疑為rAAV載體介導的基因治療帶來了福音。新的rAAV載體制備系統不但可以應用于rAAV的生產，同樣也適用于其它DNA載體的生產，至此使得大規模和有效地rAAV生產得以實現［20］。

圖3 VV輔助生產rAAV［20］

因為AAV是缺陷型的單鏈DNA病毒，AAV的DNA的復制和包裝發生于宿主細胞的核中，故現行的rAAV生產方法都需要rAAV輔助基因在宿主核中轉錄［5］。鑒于rAAV載體基因組在宿主細胞核大量的擴增，而且與輔助基因組鄰近，rAAV的Rep和Cap基因以及ITRs不可避免地發生非同源重組，從而導致rcAAV的形成。在以rAAV為載體的基因治療中，rcAAV有可能阻止轉基因的高效表達，對病人造成傷害［21，22］。

研究和臨床試驗中最主要的生產rAAV載體的方法就是三質粒共轉染法［23］，但是該法的成本和實驗條件要求都比較高，在臨床中很難得以廣泛的應用。這一新的生產rAAV的方法，利用VV的200 kb基因組復制可在宿主的細胞質中進行，不需要進入核中［24］，得以使此病毒攜帶生產rAAV所需的所有輔助基因。這個方法不但提高了rAAV的產量，也避免了非同源重組的發生，這樣也就阻止了rcAAV的干擾。

由于避免了rcAAV的干擾，這個新的重組方法沒有潛在的病毒蛋白的生成，就不會使基因治療中的轉基因治療過程復雜化，也不會對人體有害。沒有rcAAV形式的DNA干擾，也有可能對人類的基因治療造成新的威脅［25］，但是此問題現在還沒有研究清楚。隔離輔助基因于細胞質，可以阻止其與核內的復制的載體基因組共定位，同樣也會減少干擾，這又是此新方法的一個潛在優勢。而且組裝rAAV載體所需元件全由病毒提供，不但可以感染懸浮細胞，也可以模擬野生型AAV的復制和包裝機制，從而高效、高質量的制備rAAV載體，為解決rAAV的規模化生產和低免疫毒性提供了可能。

新制備系統的每個細胞的載體產量相當于傳統的轉染方法的最佳產量，表明細胞質中VV的幫助不會影響rAAV的復制和包裝。利用GFP作為報告基因可知：此法生產的載體與傳統方法相比，在體內效率一樣高效。獨特的排除rcAAV干擾和能大規模生產使得這一新方案將替代傳統的三質粒共轉染法，成為rAAV載體高效生產的首選。此外，此法靈活性很強：當需要生產其他血清型的rAAV亞型時，僅僅只需要替換確定亞型的vv-VP1和vv-VP2序列，這樣就可形成所需rAAV亞型的衣殼蛋白。VV也不是rAAV生產中最有效的輔助病毒，將腺病毒輔助基因整合到VV基因組中，能使生產更高效。腺病毒-痘苗病毒雜交體既有生長周期短，感染高效以及精準起始基因復制，同時也能使rAAV載體生長在許多哺乳細胞的懸浮液中，不僅僅是HEK293。總之，VV輔助的這一新方法加以有效利用，能夠保證人類臨床試驗所需的rAAV基因載體的質量和產量，對基因治療臨床事業的發展將有巨大的貢獻［20］。

3.3 利用酵母系統包裝AAV衣殼，為生產重組腺相關病毒提供了新思路

釀酒酵母的發育過程中支持許多不同的RNA或DNA病毒的復制，為病毒樣粒子的形成提供了一種大規模、節約成本和提高時效的方法，例如，Human Parvovirus B19。Backovic等［7］近期研究表明單鏈的AAV2基因組能在釀酒酵母RSY12中從環狀質粒起始AAV的包裝。此研究報道也證實了酵母系統中包裝AAV衣殼的可行性。

在釀酒酵母中進行AAV病毒樣粒子的包裝，至少需要AAV三個結構蛋白中的VP1和VP3參與。通過共轉染兩個質粒到酵母細胞而實施：YEplacRepCap質粒由p40啟動子來起始VP3的表達，另外由誘導酵母啟動子Gal1起始修飾的AAV2 Cap基因pYESVP1KM質粒來表達VP1蛋白。最好的方案是在含0.5%葡萄糖和5%半乳糖的培養基誘導后4.5 h得到最佳的VP1∶VP3的比例。通過兩步超速離心，就能從酵母中分離出AAV病毒樣粒子。在CsCl密度梯度離心后，衣殼樣粒子位于f8-f11部分，密度為1.386-1.394 g/cm3，有與野生型AAV2衣殼相似的衣殼蛋白。透射電子顯微鏡分析可知：由酵母獲得的AAV病毒樣粒子與人類細胞產生的空衣殼形態上相似。Backovic［7］的研究第一次表明酵母系統也能用來包裝AAV衣殼，為rAAV的生產提供了新的思路，對以rAAV為載體的基因治療臨床試驗意義重大。

4 展望

雖然在過去的十幾年中，提出了一些比較好的大規模生產rAAV載體的方法［26-28］，但由于各種各樣的不足始終無法得以推廣。例如：桿狀病毒生產系統解決了轉染問題，但在昆蟲細胞中生產rAAV會使得感染力下降［16，29，30］。細胞法生產rAAV不穩定［31］，同時需要大量篩選實現最高效。所有的載體生產系統都必須考慮輔助病毒的穩定性和安全性，現今發現的新方案，VV輔助病毒穩定且生產效率高，不會被AAV Rep和Cap基因產物所抑制，這點腺病毒無法做到。本課題組之前也設計構建了一種新型的、細胞特異性的、內含多個組織特異如肝特異和造血特異序列拷貝的microRNA結合序列的基因片段，通過控制包裝蛋白基因片段表達，進而清除腺相關病毒包裝蛋白污染誘發的rAAV載體介導的免疫反應，從而保證基因治療取得成功［32］。

隨著rAAV在基因治療中存在的問題被逐漸解決，如使用雜合的rAAV載體、對rAAV的外殼進行修飾等方法降低其免疫原性和提高轉導效率［33，34］；使用雙鏈rAAV基因組提高轉導效率［35］等，rAAV作為一種高效、安全性的轉基因載體在人類基因治療中的優勢會越發明顯。隨著rAAV規模化生產工藝不斷成熟，rAAV在基因治療上的諸多優點都表明rAAV在臨床上的廣泛應用將成為基因治療領域不可阻擋的趨勢［3］。在現今的研究基礎之上，還需要去解決面臨的新問題，從而有助于rAAV載體介導的基因治療臨床事業的迅速發展。

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（責任編輯 狄艷紅）

Research Progress Regarding to Large-scale Packaging System of rAAV

Zhan Shenbiao Tang Mingqing Gan Na Cao Yuanqing Li Zhaofa
（School of Biomedical Sciences，Huaqiao University，Quanzhou 362021）

As the only gene therapy vector certificated by EU FDA， recombinant adeno-associated virus（rAAV）has advantages of wide host range， high transfection efficiency， non-pathogenic， low immunogenicity and long-term expression of transgenosis. With the expansion of applying rAAV for gene therapy clinical trials， the shortage of capacity of packing system in traditional rAAV has emerged， thus the rAAV packaging system that can be easily enlarged and scaled up to solve the existing problem of supply and demand is in urgent need. Therefore， on the basis of describing traditional rAAV packaging system， the focus of this review is to emphatically expound the baculovirus insect cell lines，yeast， and vaccinia virus-adenovirus method， especially with more expectation to the last one. The aim of this article is to introduce several preferable systems for scale packaging of rAAV， and discuss the trend of development.

rAAV；gene therapy；vector；packaging system

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.009

2015-02-10

中央高校基本科研業務費資助項目（JB-ZR1142）

占申標，男，碩士研究生，研究方向：基因治療；E-mail：1200416004@hqu.edu.cn

李招發，男，博士，副研究員，研究方向：基因治療；E-mail：lizhaofa@hqu.edu.cn