干擾素誘導跨膜蛋白抗小兒流感的效果研究

廣東省廣州市婦女兒童醫療中心（510623）鄭健斌 張劍琿 陶建平 司徒勛 黃莉

干擾素家族(IFNs)是一類對抗病毒活性有標志功能并與細胞因子結構相關的小分子蛋白質，具有生物功能的多樣性[1]，已被廣泛應用于病毒感染疾病的預防和治療[2]。近幾年，研究發現干擾素誘導的跨膜蛋白( interferon inducible transmembrane proteins，IFITM) 1、2、3可以抑制流感病毒的早期復制。目前該蛋白的抗病毒作用及其機制已成為研究熱點。本研究通過大量閱讀以往相關文獻，探討了（IFITM)1、2、3抗小兒流感病毒的效果，現將其報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 干擾素誘導跨膜蛋白1、2、3 及 β-actin 目的基因的質粒 pVAXl-IFITMl、pVAXl-IFITM2、pVAXl-IFITM3和pMD-18T-β-actin由本院實驗中心構建并保存；真核表達載體pCMV-N-HA購自上海三維生物技術有限公司。

1.1.1 細胞株與培養 A549細胞株（人肺癌細胞系，購自中科院北京細胞庫）。用含10%胎牛血清DMEM培養基中，培養液置37℃、5%二氧化碳孵箱培養。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 A549細胞在含10%胎牛血清的DMEM培養基，含5.0%二氧化碳的37℃溫箱中培養。培養至對數生長期后，將生長狀態良好的A549細胞以3×105細胞/孔的密度接種于6孔培養板，37℃，5%二氧化碳孵育14小時[3]。

1.2.2 質粒轉染 按照X-treme GENE HP DNATransfection Reagent說明書中推薦的轉染程序，轉入相應劑量的pCMV-N-HANS質粒，6～8小時后更換培養液。同時將pCMV-N-HA空載體質粒轉染做對照并進行分析。

1.2.3 蛋白表達量檢測 將病毒液分別接入IFITM1、IFITM2、IFITM3的細胞孔中48h后，采用Western blot 方法檢測流感病毒后NS的變化，以此來證明IFITM對病毒的抵制效果。將已包裝出的病毒液按照6孔細胞板每孔1moi的量加入到應經過IFITM1、IFITM2、IFITM3的細胞孔中，并作為陰性對照，按毒48h后，收取細胞，提取總蛋白，采用Western blot 方法檢測NS的變化[4]。

1.3 統計學處理 采用SPSS 17.0 for windows軟件包，運用兩獨立樣本的值和檢驗分析方法進行數據統計分析，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IFITM對抗流感病毒A549細胞效果 將重組質粒pVIFITM1、pVIFITM2、pVIFITM3轉染到A549細胞中，等待48h后，將上述已經包裝好的病毒液分別加入過表達的細胞孔內，每孔加入1moi的病毒液，48h后收取細胞，采用Western blot 方法檢測NS的變化。結果顯示IFITM1、IFITM2、IFITM3可以有效抵制流感病毒蛋白NS的表達，見附圖。

附圖 Western blot檢測結果

3 討論

干擾素家族(IFNs)是生命體中重要的生理功能的細胞因子，但IFNs不能直接發揮抗病毒、抗腫瘤、抗免疫反應等作用，其發揮作用主要依賴于與受體（IFNR）的結合，從而誘導大量干擾素刺激基因的表達，這些刺激基因間接或直接發揮抗病毒等作用[5]。而干擾素誘導的跨膜蛋白(interferon inducible transmembrane proteins，IFITM)就是這些刺激基因中最主要的基因之一。大量研究顯示，IFITM1、IFITM2、IFITM3在細胞中的過度表達抵制了病毒蛋白的表達[6]。流感病毒是常見的易感病毒之一，其屬于正點病毒科，基因組由8個分節段的負鏈RNA組成，編碼NS1和NS2兩個非結構蛋白，其中NS1蛋白在病毒感染過程中發揮主要作用[7]。

本研究為了探討IFITM1、IFITM2、IFITM3蛋白是否具有抗流感病毒的效果，通過感染IFITM1、IFITM2、IFITM3蛋白的表達，評估其活性，同時通過檢測流感病毒蛋白的表達變化，探討IFITM1、IFITM2、IFITM3蛋白對抗流感病毒的作用，結果發現，IFITM1、IFITM2、IFITM3蛋白均具有一定的抗流感病毒效果。

綜合上述研究，IFITM1、IFITM2、IFITM3蛋白能夠抑制流感病毒NS蛋白的表達，值得臨床進行更深入的研究。