馮家豪　楊偉金　孫　政

廣州市第一人民醫(yī)院胃腸外科，廣東廣州510180

T W S119對結(jié)腸癌LO V O細胞系增殖能力和耐藥性的影響

馮家豪楊偉金孫政

廣州市第一人民醫(yī)院胃腸外科，廣東廣州510180

目的探討TWS119對結(jié)腸癌LOVO細胞系的耐藥性和增殖能力的影響。方法將LOVO細胞系分成3組，分別為2 μmol/L TWS119處理組、1 μmol/L TWS119處理組和陰性對照組，TWS119處理組加入2、1 μmol/L的TWS119，對照組加入等體積DMSO，培養(yǎng)24 h后分別進行Western blot和qRT-PCR檢測β-鏈蛋白（β-catenin）多藥耐藥相關(guān)蛋白1（MRP1）及P糖蛋白（P-gp）的表達，用流式細胞分析檢測細胞周期，用CCK8檢測細胞耐藥性變化。結(jié)果與陰性對照組比較，2 μmol/L TWS119處理組和1 μmol/L TWS119處理組細胞中MRP1、P-gp的mRNA和β-catenin、MRP1、P-gp的蛋白表達，G2/M期細胞比例均明顯升高（P＜0.05）。雖然1 μmol/L TWS119處理組在5、10 μmol/L5-氟尿嘧啶（5-Fu）作用下存活率無明顯變化（P＞0.05），但2 μmol/L TWS119處理組存活率明顯升高（P＜0.05）；而且在15 μmol/L 5-FU作用下處理組存活率明顯升高（P＜0.05）。結(jié)論在體外實驗中，TWS119可以通過上調(diào)Wnt/β-catenin信號通路活性增強結(jié)腸癌細胞的耐藥性和增殖能力，揭示癌細胞耐藥性、Wnt/βcatenin通路和ABC轉(zhuǎn)運體如P-gp、MRP1等存在聯(lián)系。

結(jié)直腸癌；化療耐藥；TWS119；Wnt/β-catenin信號通路

在各種癌癥中，全球結(jié)直腸癌患病率居第3位，僅次于肺癌和乳腺癌［1］。東亞結(jié)直腸癌發(fā)病率正在上升，可能與生活方式西方化、高脂低纖維飲食、肥胖和吸煙的流行有關(guān)［2］。大部分新發(fā)案例可以接受根治性手術(shù)［3］，但對于Ⅲ期結(jié)直腸癌患者，術(shù)后仍需化療［4］；而且20%～30%新發(fā)病例有遠處轉(zhuǎn)移，這些患者即使進行根治性手術(shù)，仍有近50%的患者發(fā)生局部復發(fā)和轉(zhuǎn)移［5］，對于這部分患者，系統(tǒng)化療顯得更為重要［4，6］。但單純化療并非根治手段，由于隨著治療的進展，癌癥耐藥性會逐步增強，這與患者藥代動力學、藥物和腫瘤類型、耐藥機制、腫瘤微環(huán)境有關(guān)，機制非常復雜［7］。Wnt（wingless integration）信號通路被證實與人類癌癥有關(guān)［8］，分為Wnt/β-catenin（cadherin-associated protein，β-鏈蛋白，β-1）通路、Wnt/Ca2+通路和WNT/PCP（planar cell polarity）通路［9］。有研究顯示，相關(guān)基因突變導致的Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控失調(diào)出現(xiàn)在大部分結(jié)直腸癌病例中［10］。Wnt/β-catenin可以調(diào)節(jié)c-myc和cyclin D1基因，它們在細胞生長、增殖和分化中起重要作用，在結(jié)腸癌中這些基因常常被異常激活［11］。TWS119是一種人工合成的小分子化合物，它可以促進老鼠胚胎腺癌細胞和胚胎癌細胞向神經(jīng)細胞方向分化，而且發(fā)現(xiàn)其作用機制為抑制糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3 beta，GSK-3β）的磷酸化作用，可使胞內(nèi)β-catenin濃度升高進而上調(diào)Wnt/β-catenin信號通路活性［12］。但TWS119對人類結(jié)腸癌細胞的作用仍未有報道。本實驗研究TWS119對LOVO細胞系的耐藥性和增殖性影響，探討其對人類結(jié)腸癌細胞的影響作用，進一步揭示W(wǎng)nt/β-catenin信號通路與人類結(jié)腸癌細胞耐藥性的聯(lián)系。

1　材料與方法

1.1細胞培養(yǎng)和藥物處理

LOVO細胞系（中山大學實驗動物中心提供）分為2 μmol/L TWS119處理組、1 μmol/L TWS119處理組和陰性對照組。在含10%胎牛血清、100 μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素的RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco），5%CO2、37℃無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，TWS119（Selleck）溶于DMSO中-20℃避光保存，處理組分別加入2、1 μmol/L TWS119［13］，陰性對照組加入等體積DMSO，培養(yǎng)24 h后進行后續(xù)實驗。

1.2qRT-PCR

收集細胞，用trizol試劑（invitrogen）提取細胞總RNA，用兩步法qRT-PCR SYBER試劑盒（TAKARA）檢測各組細胞MRP1、P-gp mRNA表達，各引物設3個復孔，引物序列（由Invitrogen公司合成）見表1。

表1　各引物序列

1.3Western blot

收集細胞，用細胞裂解液提取總蛋白，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h后一抗孵育過夜，二抗孵育1 h，曝光后掃描，使用Image J軟件分析灰度值。一抗、二抗均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.4CCK8

調(diào)整細胞密度至5×104/mL，接種于96孔板，5-氟尿嘧啶（5-FU）設5、10、15 μmol/L 3個濃度梯度，陰性對照加等體積培養(yǎng)基，各設5個復孔，無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每孔加入10 μL CCK8試劑（碧云天）作用4 h后酶標儀分析吸光度，每組重復3次。

1.5流式細胞分析

收集細胞，預冷PBS洗滌離心后用75%酒精固定過夜，碘化丙啶試劑（碧云天）染色30 min，流式細胞儀分析細胞周期。

1.6統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 15.0對數(shù)據(jù)進行分析，正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1三組qRT-PCR結(jié)果

與陰性對照組比較，2 μmol/L TWS119處理組和1 μmol/L TWS119處理組細胞中P糖蛋白（P-gp）和多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP1）mRNA表達量顯著增加（P＜0.05），且2 μmol/L TWS119處理組較1 μmol/L TWS119處理組P-gp和MRP1 mRNA表達量顯著增加（P＜0.05）。見表2、圖1。

表2　三組qRT-PCR結(jié)果

2.2三組Western blot結(jié)果

與陰性對照組比較，2 μmol/L TWS119處理組和1 μmol/L TWS119處理組細胞中β-鏈蛋白（βcatenin）、P-gp和MRP1蛋白表達量顯著增加（P＜0.05），且2 μmol/L TWS119處理組較1 μmol/L TWS119處理組β-cateniu、P-gp和MRP1蛋白表達量顯著增加（P＜0.05）。見圖2、3。

圖1　三組qRT-PCR結(jié)果

圖2　三組蛋白條帶圖（β-Actin為內(nèi)參）

圖3　三組蛋白條帶灰度值比較

2.3三組細胞在不同濃度5-FU作用下CCK8試驗結(jié)果

在5 μmol/L 5-FU作用下，2 μmol/L TWS119處理組LOVO細胞存活率高于1 μmol/L TWS119處理組和陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；但1 μmol/L TWS119處理組與陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。在10 μmol/L 5-FU作用下，2 μmol/L TWS119處理組LOVO細胞存活率高于1 μmol/L TWS119處理組和陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；但1 μmol/L TWS119處理組與陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。在15 μmol/L 5-FU作用下，2 μmol/L TWS119處理組LOVO細胞存活率高于1 μmol/L TWS119處理組和對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；1 μmol/L TWS119處理組存活率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3、圖4。

表3　三組細胞在不同濃度5-FU作用下CCK8試驗存活率（%，±s）

表3　三組細胞在不同濃度5-FU作用下CCK8試驗存活率（%，±s）

注：與陰性對照組比較，▲P＜0.05；與1 μmol/L TWS119處理組比較，*P＜0.05；5-FU：5-氟尿嘧啶

組別5 μmol/L 5-FU 10μmol/L5-FU 15μmol/L5-FU 2 μmol/L TWS119處理組1 μmol/L TWS119處理組陰性對照組P值93.12±0.76▲*87.20±1.77 80.21±0.79＜0.05 87.40±1.77▲*72.24±5.35 68.43±2.26＜0.05 80.21±0.79▲*68.43±2.26▲59.94±9.08＜0.05

圖4　三組細胞在不同濃度5-FU作用下CCK8試驗存活率

2.4TWS119對增殖細胞比例的影響

陰性對照組G2/M期細胞比例為（6.42±2.62）%、2 μmol/L TWS119處理組G2/M期細胞比例為（17.8± 1.60）%、1 μmol/L TWS119處理組G2/M期細胞比例為（11.63±1.59）%。與陰性對照組比較，2、1 μmol/L TWS119處理組中G2/M期細胞比例顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；且2 μmol/L TWS119處理組G2/M期細胞比例明顯高于1 μmol/L TWS119處理組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3　討論

通常情況下在細胞內(nèi)由軸抑制蛋白（axis inhibition protein，Axin）、結(jié)腸腺瘤樣息肉蛋白（adenomatous polyposis coli，APC）、酪蛋白激酶1（casein kinase 1）和GSK-3β組成的復合體對β-catenin有磷酸化作用，磷酸化的β-catenin隨后被泛素-蛋白酶體降解，但Wnt與胞膜上的卷曲蛋白受體（frizzled class receptor）和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6（low density lipoprotein receptor-related protein 5/6，LRP5/6）結(jié)合后，通過蓬亂蛋白（dishevelled segment polarity protein，DVL）使上述蛋白復合體受到抑制，β-catenin在胞內(nèi)得以集聚，濃度升高。β-catenin通過核孔進入細胞核，可以與T細胞因子/淋巴增強結(jié)合因子家族（T-cell factor/lymphoid enhancer-binding factor，TCF/ LEF）、環(huán)腺苷酸效應元件結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白［cAMP response element-binding protein（CREB）-binding protein，CBP］等結(jié)合，促進多種轉(zhuǎn)錄反應［14-16］。

P-gp和MRP1同屬ATP結(jié)合位點轉(zhuǎn)運體（ATP binding cassette transporter，ABC transporter）家族成員。P-gp由ABCB1基因編碼，在胞膜上有跨膜區(qū)-ATP結(jié)合位點，可以水解ATP釋放能量引起構(gòu)象改變，進而使底物排出細胞［17］。P-gp被證實與腫瘤耐藥性有關(guān)，使癌細胞抵抗蒽環(huán)類、長春堿類和紫杉醇等化療藥的毒性［18］。MRP1是從P-gp表達缺失的耐藥細胞株中發(fā)現(xiàn)的，由ABCC1基因編碼，與P-gp類似的是，MRP1也有跨膜區(qū)-ATP結(jié)合位點這種功能性結(jié)構(gòu)［19］。在乳腺癌、前列腺癌、肺癌等疾病中，MRP1過表達是化療效果不佳的預示性指標［20］。

本研究結(jié)果表明TWS119可使人結(jié)腸癌LOVO細胞系β-catenin、P-gp和MRP1表達上調(diào)，明顯提高細胞的增殖活性和5-FU耐藥性，且存在劑量依賴性。該機制可能是TWS119選擇性抑制GSK-3β磷酸化活性，導致β-catenin在胞內(nèi)濃度上升而使β-catenin/ TCF轉(zhuǎn)錄活性增強，其下游基因c-myc和cyclin-D1表達增加均可增強LOVO細胞增殖活性，而Wnt/βcatenin信號通路可能與ABCB1和ABCC1兩個基因表達有關(guān)，致使P-gp和MRP1表達增加，對5-Fu的外排作用增強，導致細胞耐藥性增加。

1 μmol/L TWS119處理組雖然有P-gp和MRP1的表達上調(diào)，但5、10 μmol/L 5-FU作用下耐藥性較陰性對照組無明顯增加，可能是由于胞內(nèi)P-gp和MRP1表達需提高至一定水平才能顯著影響LOVO細胞5-FU耐藥性；在15 μmol/L 5FU作用下1 μmol/L TWS119處理組也有顯著耐藥性，可能是因為當?shù)孜?-FU濃度較高時，P-gp和MRP1的外排泵效率也相應提高。

本研究揭示癌細胞耐藥可能與Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)，希望可以為癌細胞耐藥機制的研究提供思路。此外，TWS119在人類結(jié)腸癌細胞系中能影響信號通路的活性，可以用于信號通路的相關(guān)研究。

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Impact of TWS119 on proliferation capacity and chemotherapy resistance of colon cell line LOVO

FENG JiahaoYANG WeijinSUN Zheng
Department of Gastrointestinal Surgery，Guangzhou First People's Hospital，Guangdong Province，Guangzhou510180，China

Objective To discuss the impact of TWS119 on chemotherapy drug resistance and proliferation capacity of colon cancer cell line LOVO.Methods The cell line LOVO was divided into three group，2 μmol/L TWS119 treatment group，1 μmol/L TWS119 treatment group and negative control group，the TWS119 treatment groups were added 2，1 μmol/L TWS119，the negative control group was added equal volume of DMSO，Western blot and qRT-PCR were performed to test the expression of P-gp，β-catenin and MRP1 after 24 h treatment.Flow cytometry and CCK8 test were performed to analyze the cells tolerance change.Results Compared with the negative control group，the mRNA expression of MRP1，P-gp，the protein expression of P-gp，β-catenin and MRP1，the G2/M period cell rate in 2 μmol/L TWS119 treatment group and 1 μmol/L TWS119 treatment group significantly increased（P＜0.05）；the survival rate with 5，10 μmol/L 5-FU treatment had no significantly changed in 1 μmol/L TWS119 treatment group（P＞0.05），while those in 2 μmol/L treatment group significantly increased（P＜0.05），and the survival rate of both treatment group significantly increased with 15 μmol/L 5-FU treatment（P＜0.05）.Conclusion TWS119 can improve the chemotherapy drug resistance and proliferation capacity of colon cancer cell through increasing Wnt/β-catenin signaling pathway in vitro，these phenomena perhaps reveals there are some relationships among drug resistance of cancer cell，Wnt/β-catenin signaling pathway and the ABC transporter such as MRP1 and P-gp.

Colorectal cancer；Chemotherapy resistance；TWS119；Wnt/β-catenin

R73-36

A

1673-7210（2015）09（a）-0027-05

2015-04-08本文編輯：蘇暢）

馮家豪（1988.9-），男，廣州醫(yī)科大學2012級外科學專業(yè)在讀碩士研究生；研究方向：大腸癌多藥耐藥的分子生物學機制及治療。

孫政（1971.3-），男，博士，主任醫(yī)師，廣州市第一人民醫(yī)院胃腸外科副主任，曾獲得2007年廣州市科技進步一等獎、2008年廣東省科技進步二等獎；研究方向：胃腸道腫瘤的治療。