一株高效四環素降解菌的分離鑒定及其降解性能研究

張欣陽 蔡婷靜 許旭萍

（福建師范大學生命科學學院，福州 350108）

一株高效四環素降解菌的分離鑒定及其降解性能研究

張欣陽 蔡婷靜 許旭萍

（福建師范大學生命科學學院，福州 350108）

四環素類抗生素在畜牧養殖業中廣泛使用，但其結構復雜，難降解，容易在水環境中積蓄，進而對生態環境產生深遠影響，許多國家已將抗生素污染列為重要的環境問題展開了相關的基礎研究。近年來利用微生物降解環境中的抗生素污染物成為研究熱點。采用選擇性培養基，從某制藥廠排污口的水樣中分離篩選到1株具有較高降解四環素能力的菌株4002，經形態觀察、生理生化測定和16S rDNA序列分析，將該菌初步鑒定為Advenella sp.。從pH、溶氧量、無機鹽等方面對菌株降解四環素的性能進行研究。結果表明，該菌株降解四環素的適宜pH為7.0，在有氧條件下，30℃，150 r/min振蕩培養6 d，可使初始濃度為50 μg/mL四環素降解率達57.8%。無機鹽對降解率有顯著影響，添加FeSO4和MnSO4對四環素降解有促進作用，MgSO4影響不大，CaSO4則有抑制作用。在培養至第8天時，培養液經HPLC檢測顯示6.022 min處出現新的吸收峰，推測為降解產物。

四環素降解菌；篩選；鑒定；降解性能

20世紀40年代以來，抗生素作為藥物治療動物疾病的同時，也被用于飼料的添加劑以促進動物的生長［1］。研究表明四環素類抗生素進入動物體內后不能被完全吸收，大約有75%以原型或母體化合物的形式排出體外，這些抗生素作為環境外源性化學物對生態和環境生物將產生深遠的影響。例如，導致人類產生抗藥性等，并最終對人類的生存和健康造成危害［2，3］。四環素類抗生素由于其成本低廉、使用方便等原因在世界各國得到大量的使用。我國是世界上四環素類抗生素的生產、使用和銷售大國，2008年四環素類藥物僅出口量就達1.34×l07kg［4］。近年來，隨著對生態環境的日益關注，有關四環素類抗生素的生態毒性、殘留污染的問題越來越引起人們的重視。抗生素進入環境中會發生一系列降解反應，主要包括生物降解和非生物降解［5］。其中，非生物降解過程包括光降解、氧化降解、水解等；生物降解過程包括植物降解和微生物降解兩種方式［6］。與其他處理方法相比，利用微生物處理抗生素殘留物，條件簡單、容易控制、成本較低、專一性較強、不會引起二次污染，是目前最為經濟有效的方法，主要包括好氧處理、厭氧處理、復合菌系處理和固定化微生物處理等［7］。目前國外多為物理化學方法［8-11］、復合生物技術［12，13］及堆肥工藝［14，15］等，鮮有報道能夠降解四環素的單一微生物菌株；國內已報道少許四環素降解菌，如許曉玲［16］篩選得到的缺陷短波單胞菌（Brevundimonas diminuta）和人蒼白桿菌（Ochrobactrum anthropi）等，但總體而言并不多見。

本試驗從抗生素制藥廠排污口水樣中分離篩選出1株對四環素具有一定降解能力的細菌，對其進行分類鑒定，研究影響該菌株降解四環素的理化因素，并對其降解四環素的產物進行初步分析，為該菌應用于處理四環素環境污染奠定基礎和提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品：本實驗樣品采自福州某制藥廠排污口河道內的污水和污泥。

基礎培養基（g/L）： 牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl 5，pH7.0-7.4。該培養基用于菌種活化。選擇培養基：在基礎培養基中按照試驗要求添加不同濃度的四環素。固體培養基加入15-20 g/L瓊脂。

藥品：四環素標準品（C22H24N2O8·HCl），購于北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。

1.2 方法

1.2.1 四環素降解菌的富集、分離純化及篩選 稱取1 g污泥或吸取1 mL污水樣品，加到裝有99 mL無菌水的250 mL三角瓶中，充分振蕩后靜置片刻，取1 mL上清液加到含50 μg/mL四環素的選擇培養基中，置于30℃，150 r/min恒溫搖床中培養至培養液出現明顯的渾濁（約3 d），吸取此培養液1 mL，再接種到四環素濃度為100 μg/mL的選擇培養基中，于相同條件下培養3 d。以此類推，進行富集，每次移接時，逐步提高選擇培養基中的四環素濃度，直至350 μg/mL。富集結束時，取1 mL培養液進行梯度稀釋，取2-3個適宜稀釋度的菌液，采用平板涂布法進行分離，挑選菌落形態外觀不同的單菌落劃線進一步分離純化后，挑取單菌落接種至斜面，編號保存。

將分離獲得的各菌株分別接種到基礎培養基中，經培養后制成種子液。各取1 mL種子液接種至四環素濃度為50 μg/mL的99 mL選擇培養基內，30℃，150 r/min培養3 d后，采用藥敏試驗法測定培養液中四環素殘留量。以金黃色葡萄球菌為指示菌，測定抑菌圈直徑。抑菌圈越小的菌株，即表示其對四環素的降解能力越強。選擇降解力較高的菌株進行復篩。

1.2.2 四環素降解菌的分類鑒定

1.2.2.1 降解菌株培養特征及生理生化鑒定 將降解菌接種到基礎培養基平板上，30℃恒溫培養24 h后觀察菌落形態，并進行革蘭氏染色后用普通光學顯微鏡觀察菌體形態。根據《伯杰氏細菌鑒定手冊》［17］和《常見細菌系統鑒定手冊》［18｝進行生理生化鑒定。

1.2.2.2 降解菌株16S rDNA序列分析 提取細菌基因組DNA，正向引物為27f：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向引物為1492r：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR擴增在DL9700擴增儀上進行，擴增體系為典型擴增體系。反應條件為：94℃預變性5 min后進行35個循環，每個循環包括94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸100 s，循環結束后72℃延伸10 min。對PCR擴增后的產物進行純化，16S rDNA的測序工作由北京鼎國生物技術有限公司完成。將測得菌株的16S rDNA序列在NCBI中進行BLAST研究其同源性，選取同源性相近的細菌，構建進化樹。

1.2.3 四環素降解菌的降解性能測定

1.2.3.1 降解菌降解四環素的曲線 將降解菌接種至基礎培養基中，培養3 d制成種子液。種子液以1%接種量接種到含四環素為50 μg/mL的選擇培養基中，30℃，150 r/min振蕩培養，每隔24 h取樣測定培養液中四環素殘留量，計算降解率，繪制降解曲線。試驗設3個重復，結果取其平均值。并以相同條件下進行培養的不接菌培養基作為對照。

1.2.3.2 pH對降解菌降解四環素的影響 分別配制pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0含四環素50 μg/mL的選擇培養基，接種1%的降解菌種子液，30℃，150 r/min振蕩培養6 d，測定培養液中四環素的殘留量，計算四環素降解率。試驗設3個重復，結果取其平均值。

1.2.3.3 溶氧量對降解菌降解四環素的影響 將降解菌種子液以1%的接種量接種到含四環素50 μg/mL的選擇培養基中，分別放置于30℃有氧培養（150 r/min 振蕩培養）、缺氧培養（靜置培養，瓶口包有無菌濾膜）、厭氧培養（靜置培養，瓶口塞有厭氧橡膠塞），培養6 d后，取樣測定培養液中四環素的殘留量，計算四環素降解率。試驗設3個重復，結果取其平均值。

1.2.3.4 無機鹽對降解菌降解四環素的影響 在選擇培養基中分別添加0.03%的CaSO4，MgSO4，FeSO4，MnSO4等4種無機鹽。接種1%的降解菌種子液，30℃，150 r/min振蕩培養6 d。測定培養液中四環素的殘留量，計算四環素降解率。試驗設3個重復，結果取其平均值。

1.2.4 四環素測定方法

1.2.4.1 藥敏法 試驗步驟見參考文獻［19］，以金黃色葡萄球菌為指示菌，測定培養液的抑菌圈大小，并根據四環素含量標準曲線換算成四環素濃度。標準曲線的制作：用無菌水配制濃度分別為10、20、30、40、50、60、70及80 μg/mL等一系列濃度梯度的四環素標準溶液，分別測定不同濃度四環素對金黃色葡萄球菌的抑菌圈大小，以四環素濃度為橫坐標，抑菌圈直徑為縱坐標，制作四環素含量標準曲線，用于換算培養液中四環素的濃度。

四環素降解率（%）=（初始濃度-剩余濃度）/初始濃度×100%

1.2.4.2 高效液相色譜法（HPLC） 用HPLC分析不同培養時間培養液中四環素含量及其產物。HPLC測定方法參照文獻［20］并稍作改進。色譜條件為Waters Acquity HPLC色譜儀；Acquity HPLCTM，C18，1.7 μm，2.1 mm×50 mm色譜柱；流動相：草酸（0.01 mol/L）∶乙腈∶甲醇=70∶25∶5（體積比）；流速：0.2 mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：289 nm。進樣量2 μL。

2 結果

2.1 標準曲線的測定

采用藥敏試驗法測定不同四環素濃度對金黃色葡萄球菌的抑菌圈大小，得到標準曲線如圖1。

圖1 四環素濃度標準曲線

2.2 四環素降解菌的篩選

經過初篩和復篩得到4株降解四環素能力較強的菌株，分別編號為6、12、4001、4002。對這4株菌再次復篩，最終確定4002具有高效的四環素降解能力。

2.3 四環素降解菌4002的分類鑒定

2.3.1 形態特征及生理生化鑒定 菌株4002在牛肉膏蛋白胨培養基（基礎培養基）平板上的菌落形態見圖2。其菌落呈乳白色，表面及邊緣光滑濕潤，圓形，直徑在1- 2 mm之間。菌體呈短桿狀，大小為（0.41-1.02）μm×（0.41-1.53）μm，無芽孢，無鞭毛，為革蘭氏陰性菌，見圖3。其生理生化鑒定結果，見表1。

圖2 菌株4002菌落特征

圖3 菌株4002菌體形態（1000×）

表1 菌株4002的生理生化特征

2.3.2 四環素降解菌4002的16S rDNA序列分析

PCR擴增后的16S rDNA大小為1 432 kb，其在GenBank中申請獲得的序列號為KM191133。在NCBI中進行BLAST比對，研究其同源性，選取同源性相近的細菌，構建進化樹。

用MEGA4軟件繪制系統進化樹（圖4）可知，菌株4002與Advenella kashmirensis，strain 445C（AJ-864472）的進化關系最近。經過BLAST比對，4002與 Advenella kashmirensis，strain 445C的 16S rDNA序列相似度為99%。將該菌株初步鑒定為Advenella sp.。該菌株應用于四環素降解目前尚未見文獻報道，說明這是一種新的四環素降解菌菌種資源。

圖4 降解菌4002系統進化樹

2.4 四環素降解菌4002的降解性能

2.4.1 降解菌4002降解四環素的曲線 由圖5可知，隨著培養時間的延長，培養液中四環素的殘留量逐漸減少。接有菌株4002的試驗組顯示，前5 d四環素的殘留量下降較慢，5 d后迅速下降，在第6天達到較低值，根據標準曲線和抑菌圈直徑計算可知降解率為53.0%，高于不接菌空白對照組（34.7%）。其后繼續培養降解率提高較小，所以后續試驗確定降解周期為6 d。

圖5 降解菌4002降解四環素的曲線（抑菌圈法）

2.4.2 pH值對降解菌4002降解四環素的影響 將培養基分別調整為不同的pH，接種后進行培養，研究pH對菌株4002降解四環素的影響，結果見圖6。當pH為7.0時，抑菌圈最小，四環素的降解率為57.8%。

圖6 pH值對降解菌4002降解四環素的影響

2.4.3 溶氧量對降解菌降解四環素的影響 由圖7可知，在有氧條件下，四環素的殘留量最少，抑菌圈最小，降解率為57.8%；而缺氧培養與厭氧培養，抑菌圈基本一致，但明顯比有氧條件下的抑菌圈大。說明好氧條件更有利于菌株4002對四環素的降解。

2.4.4 無機鹽對降解菌4002降解四環素的影響 在選擇培養基中添加 CaSO4、FeSO4、MgSO4、MnSO44種不同的無機鹽進行四環素降解試驗，并以不添加無機鹽的選擇培養基作為對照，結果見圖8。在選擇培養基中添加FeSO4對菌株4002降解四環素有顯著地促進作用，培養6 d時四環素的降解率達到100%，比沒有添加的對照組提高了44.3%，其次是MnSO4，降解率為65.4%，比對照提高了9.7%。添加MgSO4的降解率為57.6%與對照組差別不大，而CaSO4的加入對四環素降解一定的抑制作用，降解率僅為34.3%。

圖7 溶氧量對降解菌降解四環素的影響

圖8 無機鹽對四環素降解的影響

2.5 HPLC 檢測四環素

用超純水配置四環素水溶液標準品，HPLC檢測出峰時間約為4.69 min。用HPLC測定不同培養時間的培養液中剩余的四環素濃度及吸收峰變化，四環素所對應的峰面積減小說明殘留量下降。結果顯示，隨著培養時間的延長，四環素的特征峰的峰面積逐漸減少（圖9-圖13）。在接種后培養的前5 d，培養液中四環素的峰面積減少較慢（圖9，圖10）；且在培養7 d內未檢測到產物峰（圖9-圖12）。但培養8 d時，四環素的峰面積明顯下降，且在6.022 min時出現新的未知物質吸收峰（圖13雙箭頭所示），可以看出在4002菌株的作用下四環素發生了降解，產生新的降解產物（其余吸收峰為培養基中物質的吸收峰）。

圖9 第3天培養液中四環素的HPLC峰面積

圖10 第5天培養液中四環素的HPLC峰面積

圖11 第6天培養液中四環素的HPLC峰面積

圖12 第7天培養液中四環素的HPLC峰面積

圖13 第8天培養液中四環素的HPLC峰面積

3 討論

已有研究表明四環素在過酸或過堿的環境下都不穩定，在過酸環境下容易發生脫水反應和差向異構化，過堿環境下易形成無效的內酯型異構體，而在中性環境下較為穩定［22］。大多數自然水體pH接近中性，不利于四環素的自然降解，本試驗菌株降解四環素適宜的pH為7.0，在四環素污染水體中則可起到有效的降解作用，有利于水體凈化。

不同的微生物具有不同的代謝類型，如好氧、厭氧、兼性厭氧等。要提高菌株的降解能力，合適的培養條件至關重要。環境中好氧微生物在充足的氧氣條件下能夠迅速生長，進而提高降解效率。據已有的實際應用可知，工業處理抗生素廢水時好氧微生物的使用更為廣泛。在試驗中，三角瓶的裝液量與溶氧量成負相關，因此可從裝液量的多少間接反應溶氧量的多少。從許曉玲［16］報道的兩株四環素降解菌的研究可見，隨著裝液量的增加，菌體的OD值下降，四環素的殘留量上升。無丙二酸檸檬酸桿菌是馬志強等人報道的一株四環素高效降解菌［23］，當裝液量從50 mL上升到200 mL時，菌株對四環的降解率降低約50%。說明微生物在好氧條件下更容易發揮對四環素的降解作用。這與本試驗菌株4002在好氧條件下的降解率好于厭氧和缺氧是相似的。無丙二酸檸檬酸桿菌在優化條件下培養3 d，四環素的去除率可以達到86.1%。但該菌適宜的降解條件為：pH 5.5，溫度35℃。

有研究指出Fe2+具有很強的光敏化作用，可以加強抗生素在環境中的降解［24］。這可以解釋本試驗在培養基中加入FeSO4后大大提高了四環素降解率的原因。與已報道的四環素降解菌Trichosporon mycotoxinivorans［25］相比，MnSO4的添加可以在一定程度上促進四環素的降解，而MgSO4則對降解率影響較小的結果是一致的；但添加CaSO4的試驗結果與本試驗略有不同。這可能與不同菌株的生長對無機鹽的要求不同有關。郝文靜等［26］報道Advenella kashmirensis具有降解海洋石油的能力，但尚未見該種細菌能夠降解四環素的相關報道。菌株4002是一種新發現的能夠降解四環素的微生物資源，其溫和的pH及培養溫度顯示出該菌在自然環境下對抗生素廢水的處理具有實際的應用前景和潛力。

4 結論

分離篩選到1株四環素降解菌株4002，經鑒定為Advenella sp.。

pH、溶氧量及無機鹽對菌株4002降解四環素的能力有影響，其中無機鹽的種類對四環素降解影響顯著。該菌株在pH7.0、有氧培養的條件下對四環素的降解能力均好于同因素的其它條件，FeSO4和MnSO4的加入均促進降解，MgSO4對降解影響不大，CaSO4對降解有一定的抑制作用。

培養8 d時，用HPLC分析可見在6.02 2min處出現了新的吸收峰，推測可能為菌株4002對四環素的降解產物。

［1］ 陳代杰. 抗菌藥物與細菌耐藥性［M］. 上海：華東理工大學出版社. 2001

［2］ Chee-Sanford JC， Mackie RI， Koike S， et al. Fate and transport of antibiotic residues and antibiotic resistance genes following land application of manure waste［J］. Journal of Environ Mental Quality， 2009， 38：1086-1108.

［3］ Martinez JL. Environmental pollution by antibiotics and by antibiotic resistance determinants［J］. Environmental Pollution， 2009， 157： 2893-2902.

［4］ 賀德春， 許振成， 吳根義， 等. 四環素類抗生素的環境行為研究進展［J］. 動物醫學進展， 2011， 32（4）：98-102.

［5］ 劉鋒， 陶然， 應光國， 等. 抗生素的環境歸宿與生態效應研究進展［J］. 生態學報， 2010， 30（16）：4503-4519.

［6］ 李偉明， 鮑艷宇， 周啟星. 四環素類抗生素降解途徑及其主要降解產物研究進展［J］. 應用生態學報， 2012， 23（8）：2300-2308.

［7］ 唐禮慶， 何成達， 羅亞紅， 等. 四環素類抗生素生產廢水處理技術進展［J］. 環境科學與管理， 2006， 31（7）：99-102.

［8］ Wang Y， Zhang H， Zhang J， et al. Degradation of tetracycline in aqueous media by ozonation in an internal loop-lift reactor［J］. Journal of Hazardous Materials， 2011， 192（1）：35-43.

［9］ Zhang H， Liu F， Wu X， et al. Degradation of tetracycline in aqueous medium by electrochemical method［J］. Asia-Pacific Journal of Chemical Engineering， 2009， 4（5）：568-573.

［10］ Reyes C， Fernández J， Freer J， et al. Degradation and inactivation of tetracycline by TiO2 photocatalysis［J］. Journal of Photochemistry and Photobiology A：Chemistry， 2006， 184. （1）：141-146.

［11］ Bautitz IR， Nogueira RFP. Degradation of tetracycline by photo-Fenton process—Solar irradiation and matrix effects［J］. Journal of Photochemistry and Photobiology A：Chemistry， 2007， 187（1）：33-39.

［12］ Yu TH， Lin A YC， Panchangam SC， et al. Biodegradation and biosorption of antibiotics and non-steroidal anti-inflammatory drugs using immobilized cell process［J］. Chemosphere， 2011， 84（9）：1216-1222.

［13］ Li B， Zhang T. Biodegradation and adsorption of antibiotics in the activated sludge process［J］. Environmental Science & Technology，2010， 44（9）：3468-3473.

［14］ Ho YB， Zakaria MP， Latif P A， et al. Degradation of veterinary antibiotics and hormone during broiler manure composting［J］. Bioresource Technology， 2013， 131：476-484.

［15］ Hu Z， Liu Y， Chen G， et al. Characterization of organic matter degradation during composting of manure-straw mixtures spiked with tetracyclines［J］. Bioresource Technology， 2011， 102（15）：7329-7334.

［16］ 許曉玲， 李衛芬， 雷劍， 等. 四環素降解菌的選育， 鑒定及其降解特性［J］. 農業生物技術學報， 2011， 19（3）：549-556.

［17］ 布坎南RE， 吉本斯NE. 伯杰氏細菌鑒定手冊［M］. 北京：科學出版社， 1984.

［18］ 常見細菌系統鑒定手冊［M］. 北京：科學出版社， 2001.

［19］ 中國獸藥典委員會. 中華人民共和國獸藥典［M］. 北京：化學工業出版社， 2000：69.

［20］ 孫剛， 袁守軍， 彭書傳， 等. 固相萃取-高效液相色譜法測定畜禽糞便中的土霉素、金霉素和四環素［J］. 環境化學，2010， 29（4）：739-743.

［21］ 胡學香， 陳勇， 聶玉倫， 等. 水中四環素類化合物在不同光源下的光降解［J］. 環境工程學報， 2012， 6（8）：2465-2469.

［22］ Halling-S?rensen B， Lykkeberg A， Ingerslev F， et al. Characterisation of the abiotic degradation pathways of oxytetracyclines in soil interstitial water using LC-MS-MS［J］. Chemosphere， 2003， 50（10）：1331-1342.

［23］ 馬志強， 馬玉龍， 謝麗， 等. 微生物法降解藥渣中殘留四環素的試驗研究［J］. 環境科學與技術， 2012， 35（1）：46-49.

［24］ 劉偉， 王慧， 陳小軍， 等. 抗生素在環境中降解的研究進展［J］.動物醫學進展， 2009， 30（3）：89-94.

［25］ 馮福鑫， 許旭萍， 程群星， 等. 四環素高效降解酵母菌Trichosporon mycotoxinivorans XPY-10 降解特性［J］. 環境工程學報， 2013， 7（12）：4779-4785.

［26］ 郝文靜. 高效海洋石油降解菌的篩選鑒定及生物修復研究［D］. 大連：大連交通大學， 2013.

（責任編輯 李楠）

Isolation and Identification of A Tetracycline-degrading Bacterium and Optimizing Condition for Tetracycline Degradation

Zhang Xinyang Cai Tingjing Xu Xuping
（College of Life Sciences，Fujian Normal University，Fuzhou 350108）

Tetracycline antibiotics have been widely used in the livestock industry， but its complex structure， difficult to degrade， easy to accumulate in the water environment and produce a far-reaching impact on the ecological environment， antibiotic pollution as an important environmental issues has expanded the related basic research. Microbial degradation of the environment antibiotic pollution in recent years become a hotspot method. The selective media was used to isolate and screen the tetracycline-degrading bacteria. A high efficiency tetracyclinedegrading bacterium（4002）was selected from sewage of a pharmaceutical factory. According to the morphological features， physiological and biochemical characteristics and the sequence analysis of 16S rDNA， the strain was identified as Advenella kashmirensi. Besides， the pH，dissolved oxygen， inorganic salts and other aspects of the strains were analyzied to study the degradation performance of tetracycline. The results showed that， the strain suitable conditions for the degradation of tetracycline are pH7.0， under aerobic condition， 150 r/min and cultured with shaking 6 d， the initial concentration of 50 μg/mL tetracycline degradation rate of 57.8%. FeSO4and MnSO4can promote degradation of tetracycline and little impact on MgSO4， but CaSO4can inhibit degradation. After cultured for 8 d， the culture solution by HPLC detection showed at 6.022 min emergence of a new absorption peak， which was speculated as the degradation product.

tetracycline-degrading strain；screening；identification；degradation performance

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.026

2014-06-18

福建省自然科學基金項目（2011J01150，2013J01123）

張欣陽，女，碩士研究生，研究方向：環境微生物；E-mail：xinyang.jun@gmail.com

許旭萍，女，教授，碩士生導師，研究方向：微生物資源與環境微生物技術；E-mail：xuping@fjnu.edu.cn