耐鹽堿石油烴降解菌的篩選、鑒定及其耐鹽堿性研究

張海榮 唐景春 孫克靜 張清敏

（南開大學環境科學與工程學院 環境污染過程與基準教育部重點實驗室 天津市城市生態環境修復與污染防治重點實驗室，天津300071）

耐鹽堿石油烴降解菌的篩選、鑒定及其耐鹽堿性研究

張海榮 唐景春 孫克靜 張清敏

（南開大學環境科學與工程學院 環境污染過程與基準教育部重點實驗室 天津市城市生態環境修復與污染防治重點實驗室，天津300071）

從大港油田區石油污染鹽堿化土壤和油泥中篩選得到10株耐鹽堿石油烴降解菌，通過形態特征、生理生化特征和16S rRNA序列分析確定這些菌株為蒼白桿菌屬、葡萄球菌屬、迪茨菌屬、棒狀桿菌屬、無色桿菌屬、微桿菌屬、芽孢桿菌屬。通過液體培養試驗，研究了10株菌的耐鹽堿能力。結果表明，除B07僅能耐受3%鹽度外，其他菌株均能耐受5%或者更高的鹽度環境，其中B02和B05在鹽度高達11%時仍具有較高的生長活性；10株菌均能耐受pH為9的堿度環境，B01、B03、B04、B06、B09能耐受pH為10的環境，其中，B03和B04在pH為11時仍具有較高的生長活性。研究表明石油烴降解菌在不同微生物種屬中廣泛存在，并具有較好的耐鹽堿特性，有望在石油污染鹽堿化土壤修復中廣泛應用。

耐鹽堿；石油污染；土壤；石油烴降解菌；生物修復

土壤石油污染是一個世界各國普遍關注的環境問題。在油田的勘探、開采以及油品的儲存、運輸和使用過程中發生的各種漏油事故，對土壤造成了嚴重的石油污染［1］。土壤石油污染不僅能夠破壞土壤，還能夠向下滲透污染地下水，揮發到空氣中污染空氣，并直接影響到人體健康［2］。

微生物降解是修復石油污染土壤的一種既有效又經濟環保的方法，國內外對于微生物修復石油污染土壤的成功實例已有很多報道［3，4］，但是石油污染土壤常常是高鹽堿環境，抑制了傳統非耐鹽堿微生物的生長代謝，使生物降解效果降低甚至消失［5］。因此篩選優良的耐鹽堿石油烴降解菌，是修復石油污染鹽堿化土壤的首要前提［6-8］。

本研究從長期受石油污染的大港油田區石油污染鹽堿土壤和油泥中，篩選到了多株具有耐鹽堿性能的石油烴降解土著微生物，通過形態觀察、生理生化特征和16S rRNA序列比對對其進行鑒定，并考察這些菌株的耐鹽堿情況，以期為石油污染鹽堿土壤的生物修復提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原油培養基 在250 mL錐形瓶中加入100 mL無機鹽培養基，并加入所需量的原油，用硅膠塞封口，然后蒸汽（121℃）滅菌15 min。

1.1.2 無機鹽培養基（M9MM）配方（1 L） 8.5 g Na2HPO4·2H2O，3.0 g KH2PO4，1.0 g NH4Cl，0.49 g MgSO4·7H2O，0.011 g CaCl2，NaCl的量根據需要加入。微量元素：0.4 mg CuSO4，1.0 mg KI，4.0 mg MnSO4·H2O，4.0 mg ZnSO4·7H2O，5.0 mg H3BO3，1.6 mg H2MoO4·2H2O，2.0 mg FeCl3·6H2O。其中1 mol/L的MgSO4·7H2O和1 mol/L的CaCl2分開滅菌之后再加入培養基中［9］。pH值根據需要調節。

1.1.3 LB培養基配方（1 L）：10 g胰蛋白胨，5 g酵母提取物，10 g NaCl，pH7.0-7.2。

1.2 方法

1.2.1 耐鹽堿原油降解菌的富集、分離與保存 分別稱取10 g石油污染土壤和10 g油泥（均采自大港油田），無菌操作將其接種于滅過菌的盛有90 mL無機鹽培養基的250 mL錐形瓶中，30℃、160 r/min條件下，振蕩培養7 d，然后取富集液10 mL接種于新鮮原油無機鹽培養基中，相同條件連續培養4-5次。馴化過程中培養基的pH、鹽度和原油（采自大港油田）含量逐漸升高，具體條件如表1所示。

表1 馴化過程中的各參數設置

取馴化完成之后的培養液梯度稀釋后涂布于LB-瓊脂平板，待菌落長出后，挑取不同形態的單菌落，并劃線純化，分離單菌。再將分離純化完成之后的單菌挑入LB液體培養基中，培養至對數生長期，5 000 r/min離心5 min，用0.85%的氯化鈉溶液沖洗兩次來除去剩余的碳源［10］，用該氯化鈉溶液重懸至原體積，梯度稀釋后涂布于M9MM-瓊脂平板，然后取少量滅菌原油涂布于該平板上，恒溫培養箱中30℃培養3-5 d，觀察是否有菌落長出，以及菌落和溶油圈的大小。

甘油保存：挑取能夠在油平板上生長的菌株接種于LB培養基，長至對數期，在滅過菌的2. 0 mL離心管中加750 μL活化后的培養液和750 μL滅過菌的50%甘油，旋渦5 min混勻，然后將離心管做好標記置于-80℃冰箱中保存。

1.2.2 菌株形態觀察 在OPTEC解剖鏡下觀察每種菌株在LB-瓊脂平板和M9MM-瓊脂平板上的菌落形態。革蘭氏染色，并在顯微鏡（OLYMPUS CX31）下1 000×油鏡鏡檢觀察細菌的形態。

1.2.3 菌株鑒定 利用OMEGA bio-tec細菌DNA提取試劑盒D3350-01對每種菌株的基因組DNA進行提取。提取結果通過1%的瓊脂糖凝膠電泳來監測。

對提取的DNA進行16S rRNA PCR擴增，所用引物為：27F（5'-AGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）［11］。PCR反應體系（50 μL）（原料購自北京全式金生物技術有限公司）為：3 μL模板DNA，5 μL 10×EasyTaq? Buffer，4 μL dNTPs（2.5 mmol/L），1 μL EasyTaq? DNA Polymerase，27F、1492R各1 μL，35 μL ddH2O。PCR擴增條件為：94℃預變性5 min；94℃預變性1min，退火溫度從65℃到55℃，每個循環降低1℃，72℃延伸1min，共10個循環；然后94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，共25個循環；再72℃延伸7 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳監測PCR產物。

將16S rRNA PCR產物送至北京華大科技有限公司測序，使用EzBioCloud（http：//www.ezbiocloud. net/eztaxon）在線比對序列，確定該菌株的近緣模式種及其相似性。從GenBank中調取與分離菌株最相似的菌株序列構建系統發育樹，用Mega6.06軟件包中的Kimura 2-Parameter Distance模型進行多序列匹配排列，以鄰接法（Neighbor-Joining Method）重復1 000次計算構建16S rRNA系統發育樹。

1.2.4 菌株的生長曲線 將菌株接種至LB培養基中，30℃、180 r/min搖床培養，根據菌株生長快慢的不同選取不同的時間間隔取樣（B01、B02、B05、B06、B07和B09為2 h，B08為3 h，B04和B05為12 h），測定菌液的吸光度OD（λ=600 nm），以時間與OD600做每種菌的生長曲線。

1.2.5 菌株耐鹽試驗 以LB液體培養基為基礎，將NaCl濃度分別設置為5、10、20、30、50、70、90和110 g/L，接種量為1%，pH調至7.0-7.2，30℃、180 r/min恒溫搖床培養至對數期，于600 nm波長處測定吸光度OD值。

1.2.6 菌株耐堿試驗 以LB液體培養基為基礎，將pH值分別設置為5、6、7、8、9、10和11，鹽度設置為1%，接種量為1%，30℃、180 r/min恒溫搖床培養至對數期，于600 nm波長處測定吸光度OD值。

2 結果

2.1 石油降解菌的篩選

通過在M9MM-瓊脂原油平板上涂板培養，能夠在以原油為唯一碳源的平板上長出菌落的菌株被認為具有降解原油的作用，試驗共獲得10株石油降解菌，石油污染土壤中獲得5株（編號為B01、B02、B03、B04和B05），油泥中獲得5株（編號為B06、B07、B08、B09和B10），原油平板圖片（圖1）（取部分）顯示，菌株在以原油為唯一碳源的培養基上能夠較好地生長，且B05菌落周圍具有明顯的溶油圈，說明其生長過程中可能產生了生物表面活性劑。

圖1 B01、B03、B05、B07在以原油為唯一碳源的油平板上的生長情況

2.2 菌株形態觀察

10株菌在LB-瓊脂平板上的菌落形態如表2所示。由表可知，B01、B06、B07、B08為革蘭氏陰性菌，其余為革蘭氏陽性菌。B01、B02、B05、B06、B07和B10在LB-瓊脂平板上的菌落為白色或乳白色；B03和B09為橘紅色；B04為橘黃色；B08為黃色。除B05和B10菌落表面干燥之外，其他菌株菌落表面均濕潤。除B10菌落形狀不規則，其他菌菌落為圓形。

表2 耐鹽堿石油烴降解菌的菌落形態

10株菌革蘭氏染色后的鏡檢部分結果如圖2所示，其中，B01、B06和B07菌株形態相似（圖2中B01），為革蘭氏陰性桿菌，菌體長度為2.0 μm左右；B02為革蘭氏陽性球菌，菌體直徑為1.0 μm左右；B03、B04和B09菌株形態相似（圖2中B04），為革蘭氏陽性短桿菌，菌體長度為1.0 μm左右；B05為革蘭氏陽性桿菌，菌體長度為1.5 μm左右；B08為革蘭氏陰性短桿菌，菌體長度為0.5 μm左右；B10為革蘭氏陽性桿菌，菌體長度為2.5 μm左右，菌體中間可看出有淺色芽孢存在。

圖2 革蘭氏染色后1000×顯微鏡下觀察到的細菌形態

2.3 石油降解菌的分子生物學分析

10株菌的DNA提取和16S rRNA PCR產物電泳結果（圖3）顯示，所有的電泳條帶均很亮，說明10株菌的DNA提取以及16S rRNA PCR結果成功。

圖3 10株菌的DNA提取和16S rRNA PCR產物電泳圖

表3 石油烴降解菌的16SrRNA基因序列鑒定結果

10株耐鹽堿石油降解菌的16S rRNA基因序列通過在EzBioCloud中在線比對，得到每株菌的近緣模式種及相似性結果（表3）顯示，經篩選所獲得的10株耐鹽堿石油烴降解菌與GenBank中已知的16S rRNA基因序列有較高的同源性，同源性在98.5%以上。利用MEGA6.06軟件構建10株菌和GenBank中親緣關系較近菌株的系統發育樹（圖4）顯示，B01和B07屬于蒼白桿菌（Ochrobactrum）屬，B02為葡萄球菌（Staphylococcus）屬，B03、B04和B09為迪茨菌（Dietzia）屬，B05為棒狀桿菌（Corynebacterium）屬，B06為無色桿菌（Achromobacter）屬，B08為微桿菌（Microbacterium）屬，B10為芽孢桿菌（Bacillus）屬。

圖4 10株耐鹽堿菌基于16S rRNA序列的系統發育樹

2.4 菌株的生長曲線以及耐鹽堿結果

2.4.1 生長曲線 10株菌的生長曲線如圖5顯示，B01、B02指數期在8 h左右，12 h之后進入平衡期；B05、B06、B07和B09指數期在12 h左右，16 h之后進入平衡期；B08指數期在20 h左右，27 h之后進入平衡期；B03、B04和B09指數期在72 h左右，48 h之后進入平衡期。結果表明B1、B2、B5、B6、B7和B8生長較快，B3、B4和B9生長較慢，微生物的不同生長情況可為微生物的實際應用價值提供重要參考。

圖5 10株耐鹽堿菌株的生長曲線

2.4.2 菌株的耐鹽性 10株菌的耐鹽性檢測結果（圖6）顯示，10株菌的最適鹽度都在2%左右，且在鹽度≤3%時均具有較好的生長活性。其中B05在鹽度＜3%時隨鹽度增加生長活性逐漸增加，在3%＜鹽度＜7%時生長活性基本不變，鹽度＞7%時生長活性開始呈下降趨勢，但直到鹽度為11%時，B05菌具有較高的生長活性，說明B05的耐鹽能力非常強；B10在鹽度＜7%時，隨鹽度的增加菌株的生長活性逐漸增大，但當鹽度＞7%時，菌株的生長活性急劇下降，說明B10為嗜鹽菌，但其最高耐受鹽度為7%；當鹽度＞3%時，B02、B03、B04、B09生長活性呈逐漸下降的趨勢，但并沒有急劇下降；B01、B06、B07、B08均是當鹽度大于某一值時，生長活性急劇下降，其中B01在2%＜鹽度＜5%時下降比較緩慢，鹽度＞5%生長活性急劇下降，認為當鹽度＞5%時B01不能生長。同理，B06當鹽度＞5%不能生長，B07在鹽度＞3%時不能生長，B08在鹽度＞5%時生長活性極低，在鹽度＞7%時不能生長。綜合上述分析，B02、B03、B04、B05、B09和B10具有較好的耐鹽性能。

2.4.3 菌株的耐堿性 10株菌的耐堿性檢測結果（圖7）顯示，10株菌在6＜pH＜9時均具有較高的生長活性，除B05、B07、B10的最適pH為7外，其他菌的最適pH均在8。其中B03、B04在pH≥11時仍具有較高的生長活性，說明其耐堿性能非常強；B01在pH＜10時生長活性基本不變，說明B01的耐堿能力也較強。當pH＞10時生長活性急劇下降，說明當pH＞10時，B01不能生長；B02和B08在pH＞8時，生長活性開始下降，但當pH為9時，菌株仍具有較高的生長活性，pH為10時生長活性較低，pH為11時，菌株不能生長；B06和B09在pH＞9時，生長活性開始下降，但當pH為10時，菌株仍具有較高的生長活性，pH為11時，菌株不能生長；B05、B07、B10能夠耐受pH為9的條件，當pH≥10時，菌株不能生長。綜合上述分析，除B02和B08外，其他8種菌均具有較好的耐堿性能。

3 討論

本研究從天津大港油田區石油污染鹽堿土壤及油泥中篩選出10株耐鹽堿石油烴降解菌，通過16S rRNA序列分析確定10株菌分別為蒼白桿菌（Ochrobactrum）屬，葡萄球菌（Staphylococcus）屬，迪茨菌（Dietzia）屬，棒狀桿菌（Corynebacterium）屬，無色桿菌（Achromobacter）屬，微桿菌（Microbacterium）屬，芽孢桿菌（Bacillus）屬。根據之前的文獻報道，蒼白桿菌屬［12-14］、葡萄球菌屬［14，15］、迪茨菌屬［16-19］、棒狀桿菌屬［20，21］、無色桿菌屬［22-24］、微桿菌屬［25］、芽孢桿菌屬［26，27］均具有在高鹽堿環境下降解石油烴的能力。

迄今為止，對于石油烴降解菌的篩選和鑒定的報道非常多，但對于高耐鹽堿石油烴降解菌的報道還不是很多，宋立超等［28］通過篩選耐鹽堿PAHs高效降解菌并通過固定化、添加表面活性劑的方法有效治理了鹽堿地石油污染土壤；張竹圓等［29］在遼河口濕地土壤中篩選到兩株耐鹽堿石油烴降解菌，對石油中所有正構烷烴的去除率均在85%以上；Nicholson等［30］篩選得到的嗜鹽微生物菌群對俄克拉荷馬州石油區石油烴污染鹽土具有較好的處理效果。微生物的耐鹽堿性能決定了其在自然環境中修復石油污染鹽堿化土壤的效果［31］。

圖6 10株耐鹽堿菌株的耐鹽情況

圖7 10株耐鹽堿菌株的耐堿情況

本研究耐鹽性試驗的結果表明，B05能夠耐受11%的鹽度，B10能夠耐受7%的鹽度，B01、B06和B08能夠耐受5%的鹽度，B07能夠耐受3%的鹽度，當鹽度＞3%時，B02、B03、B04、B09生長活性呈逐漸下降的趨勢，說明過高的鹽度對菌株的生長造成了一定的毒害，但菌株的生長活性沒有急劇下降，說明菌株鹽度較高時，菌株仍具有一定的耐受能力，綜合上述分析得出B02，B03，B04，B05，B09，B10具有較好的耐鹽性能；耐堿性試驗的結果表明，B03和B04能夠耐受pH為11的環境，且除B02和B08外，其它菌均具有較好的耐堿性能。綜合考察本研究中10株菌對鹽堿的耐受情況，發現B03、B04、B05、B09和B10具有較好的耐鹽和耐堿性能，有望在鹽堿化石油烴污染現場應用。

在資源短缺與環境污染日益嚴峻的背景下，耐鹽堿菌作為一條有效可行的生物學途徑，能夠充分發揮自身潛力，減輕高鹽堿石油污染對環境所造成的壓力。篩選得到的耐鹽堿石油烴降解菌在修復石油污染鹽堿化土壤中具有很大的應用潛力。

4 結論

本研究從天津大港油田石油污染鹽堿化土壤中分離出10株細菌，經過初步液體培養和油平板培養試驗，發現10株菌均有較好的原油乳化和降解性能。通過形態特征、生理生化特征和16S rRNA序列分析確定這些菌株為蒼白桿菌屬、葡萄球菌屬、迪茨菌屬、棒狀桿菌屬、無色桿菌屬、微桿菌屬、芽孢桿菌屬。這表明石油降解微生物在不同種屬中廣泛存在。

耐鹽堿試驗表明，10株菌均有較高的耐鹽堿性能。在鹽度為3%，pH為9的鹽堿環境下，10株菌的生長性能均未受到影響。其中，菌B02和B05能夠耐受11%的鹽度環境；菌B03和B04能夠耐受pH為11的堿度環境。菌B03、B04、B05、B09和B10為具有較好耐鹽堿性能的微生物，有望在鹽堿化石油烴污染現場應用。

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（責任編輯 馬鑫）

Isolation and Identification of Saline-alkaline Tolerant Hydrocarbondegrading Strains and Study on Their Saline-alkaline Tolerant Characteristics

Zhang Hairong Tang Jingchun Sun Kejing Zhang Qingmin
（College of Environmental Science and Engineering，Nankai University，Key Laboratory of Pollution Processes and Environmental Criteria（Ministry of Education），Tianjin Key Laboratory of Environmental Remediation and Pollution Control，Tianjin 300071）

10 saline-alkaline tolerant strains which can degrade hydrocarbons were isolated from a petroleum-contaminated saline soil in Dagang oilfield of China. According to their morphology， physiochemical characteristics and 16S rRNA sequence analysis， the 10 strains were identified as Ochrobactrum， Staphylococcus， Dietzia， Corynebacterium， Achromobacter， Microbacterium and Bacillus. Moreover， a series of liquid incubation experiments were conducted to investigate their saline tolerant and alkaline tolerant characteristics. The salt resistance test demonstrated that 10 strains grew well at NaCl concentrations ranging from 0.5% to 5.0% or even higher except B07 which could grow under 3% of NaCl. B02 and B05 still had high growth activity under a salinity of 11%. The alkalinity resistance test demonstrated that all the 10 strains grew well at pH 9. Besides， B01， B03， B04， B06 and B09 could endure the pH of 10， B03 and B04 still had high growth activity with the pH of 11. The results indicated that petroleum-degradation bacteria with high saline tolerant and alkaline tolerant abilities were widespread among different microbial species. Therefore， they are expected to be widely used in the remediation of oil-contaminated saline alkaline soil.

saline-alkaline tolerance；petroleum contamination；soil；petroleum-degradation bacteria；bioremediation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.023

2014-06-23

國家自然科學基金面上項目（31270544），國家高技術研究發展計劃（“863”計劃）重大項目（2013AA06A205），教育部博士點基金項目（博導類）（20120031110015）

張海榮，女，碩士研究生，研究方向：生物修復；E-mail：zhanghairong1017@sina.com

唐景春，男，教授，研究方向：生物修復；E-mai：tangjch@nankai.edu.cn