玉竹褐斑病拮抗細菌的分離篩選和鑒定

畢博孟慶龍包京姍

（1.吉林農業科技學院，吉林　132109；2.長春市南關區中醫院，長春　130118；3.吉林農業大學中藥材學院，長春　130118）

玉竹褐斑病拮抗細菌的分離篩選和鑒定

畢博1，2孟慶龍2包京姍3

（1.吉林農業科技學院，吉林132109；2.長春市南關區中醫院，長春130118；3.吉林農業大學中藥材學院，長春130118）

從吉林農業科技學院藥植園采集的玉竹根際土壤中分離、純化獲得90株細菌，運用平板對峙法篩選出16株對銳頂鐮孢菌（Fusarium acuminatum）具有較好拮抗作用的菌株。采用生長速率法對抑菌能力最強的G-27菌株進行抗菌譜的測定，并進行盆栽實驗以驗證其對玉竹褐斑病的防治效果。抑菌實驗結果表明，G-27菌株發酵液對銳頂鐮孢菌的抑制率達87.67%，同時對辣椒疫霉病菌等10種植物病菌也具有較好的抑菌作用，展現了較好的廣譜抑菌作用。盆栽實驗結果表明，G-27對玉竹褐斑病的防治效果為70.01%和71.52%，與農藥對照組相比均具有顯著差異（P＜0.05），其20倍稀釋的發酵液的防效仍能達到50%以上。經形態特征、生理生化特性鑒定及16S rDNA序列分析，確定G-27為解淀粉酶芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

玉竹；銳頂鐮孢菌；拮抗；解淀粉酶芽孢桿菌；生物防治

百 合 科 玉 竹［Polygonatum odoratum（Mill.）Druce］為多年生草本植物，可藥食兩用，其功效已被世人所熟知，屬于我國大宗地道性藥材之一［1］。近些年來，伴隨著玉竹相關研究的不斷深入，玉竹藥材的市場需求量在不斷增加，大面積開采野生玉竹已無法滿足市場的供需平衡，同時野生玉竹資源的不斷減少，破壞了物種的多樣性，引發了人們的廣泛關注。為了解決玉竹的市場供需危機，其人工馴化撫育工作已經展開，目前部分分布地區也已對玉竹實現了農業化種植養殖生產，逐步成為玉竹原料供應的主體［2］。但目前作為影響玉竹藥材安全性的重要因素，植物病害對玉竹的品質和產量存在極大的影響。由銳頂鐮孢菌（Fusarium acuminatum）引起的玉竹褐斑病（Cercospora chinensis Tai）主要危害玉竹的葉片部分，出苗之后即發病，一般5月中旬至6月下旬為病情流行期，7月上旬以后基本趨于穩定。病原菌產生的分生孢子可多次侵染植物葉片，造成早期葉枯而導致規模性減產［3］。

現階段防治玉竹真菌性病害多從農業防治和化學防治角度出發，周陽陽等［4］在研究玉竹病害發生規律的過程中發現，有機硫類和唑類殺菌劑防治玉竹褐斑病效果最優；賈秀梅［5］認為合理運用50%多菌靈500倍稀釋液并結合常規的農業防治辦法可以有效防治玉竹褐斑病；也有研究者認為，防治玉竹褐斑病預防尤為主要，在發病前噴灑波爾多液或代森銨藥劑對于防治病害的發生具有關鍵性作用［6］。長期施加化學農藥對土壤的微生態環境存在不利影響［7］，并且加重環境污染，也使有毒物質在植物體內積累［8］，降低玉竹的使用安全性和商品價值。目前對于藥用植物病害的防治，國內外研究者已經將目光轉向生物防治，由于其具備綠色、安全、有效的特點，因此也是當前的研究熱點之一［9，10］。為此，本研究以銳頂鐮孢菌作為靶標菌，從玉竹根際土壤中分離篩選防治效果較好的細菌，旨在為開發利用土壤微生物資源和綜合防治玉竹褐斑病提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 銳頂鐮孢菌（Fusarium acuminatum）由吉林農業科技學院藥植實驗室提供；13種植物病原菌由吉林省農業科學院提供。

1.1.2 培養基［11］馬鈴薯葡萄糖（PDA）培養基：去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂22 g，pH7.0。牛肉膏蛋白胨（NB）固體培養基：牛肉膏3.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g，瓊脂20 g，pH7.0-7.2；NB培養液：配方同上但不添加瓊脂。BPY［Beef extract-Prptone-Yeast extract（Medium）］發酵液：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，酵母浸膏5 g，葡萄糖5 g， NaCl 5 g，蒸餾水1 000 mL，pH6.8。

1.1.3 主要試劑和儀器 50%多菌靈（吉林市綠盛農藥化工有限公司），DNA Marker和PCR擴增試劑盒（TaKaRa公司），PCR產物純化試劑盒（上海生工），細菌通用引物（長春聯星生物技術有限公司合成），其他常規分析純試劑購自北京化工廠等。UV-1700型紫外/可見分光光度計（SHIMADZU），GAPS-9700型 PCR儀（AB App lied Biosystems），HPG-320H型人工氣候箱（哈爾濱東聯電子科技有限公司），DYCP-31DN水平電泳儀（北京市六一儀器廠），GIS-2010型凝膠成相系統（上海天能科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 土壤細菌菌株的分離、純化、保存 運用五點采樣法，從吉林農業科技學院藥植園采集玉竹根際土樣若干，土壤經風干后過20目篩備用。稱取樣品10 g，將其裝入含有90 mL去離子無菌水的三角瓶中，充分振蕩30 min，混勻后靜置5 min。無菌條件下取1 mL上清液，加入9 mL 0.05%十二烷基苯磺酸鈉液，于恒溫箱30℃保溫10 min后取液1 mL，加入9 mL無菌水，按10-3、10-4和10-5梯度制成稀釋液。分別吸取100 μL各稀釋液，涂布于NB平板上，每處理3次重復，置于人工氣候箱內32℃培養 24 h。菌株純化、編號，4℃保藏備用。

1.2.2 發酵液制備 將4塊直徑為8 mm的細菌菌餅接入含無菌 NB培養液的錐形瓶（裝液量100 mL/250 mL），190 r/min，30℃振蕩培養24 h；取2% NB種子液接入含有無菌 BPY發酵液的三角瓶（裝液量50 mL/200 mL），185 r/min，30℃振蕩培養24 h，所得BPY菌株發酵液（如下簡稱BPY）保存備用。如上發酵液均調至含菌量約為108CFU/mL。

1.2.3 拮抗菌株的活性測定

1.2.3.1 初篩 采用濾紙片法［12］，每處理3個重復，以不接供試細菌為對照，30℃培養6-7 d后待對照組菌落長滿平板，測量處理菌落直徑。計算抑制率，從中選取抑制率較高的菌株進行復篩。

1.2.3.2 復篩 將初篩得到的菌株制備NB種子液后，以5%接種量接種到BPY中（裝液量50 mL/200 mL），34℃、185 r/min搖床培養24 h，所得發酵液備用。采用牛津杯法［13］，每處理3次重復，28℃培養7 d后測量處理菌落直徑并計算其抑菌率。

1.2.3.3 抑菌譜測定 用生長速率法［14］對活性菌株進行抑菌譜測定。

抑菌率（%）=［（A-B）/（A-8）］×100%其中，A為病原菌正常生長直徑，B為被拮抗后病原菌直徑，數字為病原菌菌餅直徑。

1.2.4 室外盆栽防病試驗

1.2.4.1 盆栽方法 采用盆缽種植方式，將營養土：蛭石按照3∶1體積比配制基質填裝于15 cm×20 cm育苗盆缽中。取當年生粗壯玉竹分支，將其表面消毒洗凈（50℃水中浸泡5 min）后浸泡于預先配置好的菌株發酵液（菌量約為108CFU/mL）中，25-30 min后取出移栽于裝有育苗土的花盆中，每盆4株，5盆1組，每組3次重復。定苗后進行灌根接種。

1.2.4.2 防病測定 保護作用測定：在玉竹苗根莖部分別灌澆10 mL BPY發酵液，24 h后接種10 mL銳頂鐮孢菌孢子懸浮液（5×104孢子/mL）；治療作用測定：先接種銳頂鐮孢菌孢子懸浮液10 mL，24 h 后再灌注等量BPY菌株發酵液。藥劑對照為50%多菌靈500倍液，空白對照為清水，每處理重復3次。接種病菌 25-30 d后調查發病情況，計算病情指數和防治效果。

玉竹褐斑病發病程度參考郭巧生［15］的方法分為5級。0級：未發病；1級：病斑面積占總葉面積10%以下；2級：病斑面積占總葉面積11%-20%；3級：病斑面積占總葉面積21%-40%；4級：病斑面積占總葉面積41%-60%；5級：病斑面積占總葉面積60%以上。病情參數和防效分別按照下列公式計算［16］：

病情參數=［∑（病級植株數×代表值）/（總植株數×最高病級代表值）］×100

防效（%）=（對照病情參數-處理病情參數）/對照病情參數×100%。

1.2.5 菌株鑒定

1.2.5.1 菌落形態與生理生化試驗 實驗方法參閱《常見細菌系統鑒定手冊》［17］。對劃線于固體培養基的菌株進行表態觀察，并通過革蘭氏染色觀察菌株個體形態特征。生理生化實驗包括：硝酸鹽還原實驗、耐鹽性培養（2 %、5%、7%和10%）、運動性、接觸酶反應、明膠液化、淀粉水解、檸檬酸鈉鹽利用、乙酰甲基甲醇實驗（V-P反應）、碳水化合物利用（D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露醇）。

1.2.5.2 16S rDNA基因序列分析 PCR擴增菌株的16S rDNA序列［18，19］，通用引物［20］為16S1F和16S1R。PCR 擴增反應體系（50 μL）為：基因組DNA 2 μL、dNTP（10 mmol/L）2 μL、10×Buffer 5 μL、16S1F 2 μL、16S1R 2 μL、Taq酶（2.5 U/μL）2 μL、雙蒸水35 μL。PCR 擴增條件：94℃預變性5 min；94℃ 1 min，58℃ 30 s，70℃ 90 s，35個循環；72℃延伸10 min。純化后的 PCR 產物送交上海生工生物工程技術服務有限公司測序。序列登陸GenBank獲得登錄號并且進行同源性比較，應用Clustal X［21］進行多重比對后，利用MEGA5.1軟件以鄰位法構建系統發育樹，進行系統進化分析。

1.2.6 數據分析 應用 DPS 9.50標準版統計處理原始數據，Duncan氏新復極差法分析差異顯著性。

2 結果

2.1 細菌分離及拮抗菌株的篩選

從玉竹的根際土壤中共分離得到細菌90株。運用平板對峙法，以銳頂鐮孢菌為標靶菌株，測定供試細菌對病原真菌的拮抗能力。其中8株細菌對銳頂鐮孢菌的抑制率在50% 以上，菌株G-27和G-36抑制率均在70% 以上，G-27的抑菌能力最強，抑菌率高達87.67%（圖1），經過多次驗證后其抑菌效果仍然較為穩定（表1）。

圖1 G-27對銳頂鐮孢菌拮抗抑制效果

2.2 菌株G-27的抑菌譜

菌株G-27對16種致病菌的拮抗結果表明，G-27對南瓜枯萎病菌、稻瘟病菌、楊樹潰瘍病菌等5種病原菌無明顯抑制作用，對油菜菌核病菌等4種供試真菌的抑制作用小于50%，對銳頂鐮孢菌、辣椒疫霉病菌、玉米小斑病菌等7種病原菌的抑制作用為 52%-87%，其中對銳頂鐮孢菌的抑制作用為87.67%，說明菌株G-27的抑菌譜較寬（表2）。

表1 細菌對銳頂鐮孢菌生長的抑制作用

表2 菌株G-27對病原真菌的抑制作用

2.3 菌株G-27對玉竹褐斑病的盆栽防效

結果顯示，G-27菌株 BPY發酵液對玉竹褐斑病的保護及治療作用分別為 70.01%和71.52%，10倍和20倍菌株發酵稀釋液的保護和治療作用分別可達66%和60% 以上，顯著性差異結果（表3）顯示，菌株G-27發酵液處理對玉竹褐斑病的防治優于農藥組（P＜0.05）。

表3 菌株G-27對玉竹褐斑病的防治效果

2.4 菌株G-27的形態學特征及理化特性

形態觀察結果顯示，G-27菌落不規則，邊緣不整齊、乳黃色、中心隆起、表面較濕潤、半透明。鏡檢呈桿狀，大小為（0.4-0.5）×（2.5-2.7）μm，具鞭毛，G+，有芽孢，具有典型的芽孢桿菌特征（表4）。

表4 生防菌G-27理化特征

菌株G-27可在20-35℃的溫度下生長，其最適生長溫度為30℃。其生長pH范圍為6.5-7.5，最適生長pH為7.0。菌株G-27屬需氧生長；硝酸鹽還原反應生成紅色化合物；接觸酶測定為陰性；脂肪酶反應為陽性；酪蛋白、酪氨酸反應呈陰性；能利用D-葡萄糖、D-木糖；淀粉水解實驗鏡檢有糊精生成；明膠液化呈陽性；檸檬酸鹽利用培養基呈酸性（綠色）；VP（pH7.0）測定生成紅色化合物；L-阿拉伯糖、甘露醇呈陰性；在加入5%-10%的NaCl的牛肉膏蛋白胨培養基上均能生長。由此說明菌株G-27的生理生化特性與芽孢桿屬菌較為接近（表5）。

2.5 16S rDNA序列分析

經16S rDNA測序分析，擴增后菌株G-27的序列長度為1 475 bp，將這一序列提交至GenBank 后，獲得注冊號KC511118。將G-27的16S rDNA 序列進行BLAST比對后結果顯示，與報道菌種解淀粉酶芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens strain BCRC 11601（登錄號NR_116022.1）的相似性為99%；以鄰位法構建系統發育樹，結果（圖2）顯示，G-27菌株與B. amyloliquefaciens（登錄號FN597644.1）處于同一分支，相似性達100%。結合形態學、生理生化特征結果，菌株G-27可鑒定為解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciens。

圖2 菌株G-27的系統發育樹

3 討論

植物的體內、體表及根莖葉等部位都存在病原菌和對植物有益的腐生微生物系統，它們之間存在著拮抗、寄生和競爭等各種各樣的關系［8］。而目前國內外對于植物病害生物防治的相關研究工作，均是基于植物腐生微生物與病原菌之間的相互關系這一原理展開的，其中通過人工分離篩選的辦法從自然生境獲取生防菌源是實現生物防治的重要一環。普遍認為用作防治植物病害的理想生防菌源應具備如下特點［22］：（1）可強烈抑制或破壞病原菌生長和繁殖；（2）具備多種防病機制；（3）特異性明顯，對包括動植物及有益微生物的非標靶生物不存在傷害；（4）規定濃度下可以將病害控制在允許范圍內；（5）具備實際市場應用性。

細菌作為生防菌防治植物病害主要是利用其強力的競爭機制，其中芽孢桿屬（Bacillus spp.）細菌由于具有抗逆性強、繁殖速度快、易于培養等優點而被廣泛用作生防菌源。李德全等［23］應用枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis 916菌株防治大田水稻紋枯病效果顯著；秦娟娟等［24］利用枯草芽孢桿菌（B. subtilis）研制的固態菌劑對辣椒疫病的防治效果顯著；國外利用短小芽孢桿菌（B. pumilis）防治植物病害也起到了較好的效果［10］。本研究首次發現并證實了解淀粉酶芽孢桿菌B. amyloliquefaciens G-27對銳頂鐮孢菌（Fusarium acuminatum）具有明顯的抑菌效果，抑菌率高達87.67%，抗菌譜實驗證明其對多種植物病害具有一定拮抗抑制作用，拮抗廣譜性強；對玉竹褐斑病的盆栽實驗顯示，施加B.amyloliquefaciens G-27菌株發酵液對玉竹褐斑病的防病效果優于農藥對照組（P＜0.05），保護和治療作用效果分別為70.01%和71.52%，以拮抗細菌發酵液代替常用化學農藥，顯著降低了植株的病情指數，取得了良好效果。Bacon等［25］認為，芽孢桿屬菌株分泌的抗生素、生物素等次生代謝產物也是體現其防病作用的重要機制，有關B. amyloliquefaciens G-27產生的抗菌物質分離純化及其抗菌物質的分子機制需進一步研究，其實際應用價值也仍需進行大田試驗后方能驗證。

4 結論

通過對玉竹根際土壤中細菌進行分離、初篩和復篩，獲得1株對銳頂鐮孢菌的菌絲生長具有較強抑制活性的細菌菌株G-27，其抑制率為87.67%；其對辣椒疫霉病菌、玉米小斑病菌等11株植物病原菌同樣具有拮抗抑制作用，具備廣譜抑菌能力。菌株G-27發酵液對玉竹褐斑病的防病效果優于農藥對照組（P＜0.05），保護和治療作用效果分別為70.01%和71.52%。利用傳統分類方法和16S rDNA序列測定對菌株進行了鑒定，將菌株G-27鑒定為解淀粉芽孢桿菌B. amyloliquefaciens。

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（責任編輯 馬鑫）

Isolation，Screening and Identification of Bacteria Antagonistic to Cercospora chinensis

Bi Bo1，2Meng Qinglong2Bao Jingshan3
（1. Jilin Agriculture Science and Technology University，Jilin132109；2. Traditional Medicine Hospital of Nanguan District，Changchun 130118；3. College of Chinese Medicines，Jilin Agricultural University，Changchun130118）

Using the plate confrontation assay， 16 strains with antagonistic effects on Fusarium acuminatum were screened from 90 bacteria isolated from the rhizosphere of Polygonatum odoratum growing in medicinal garden of Jilin Agriculture Science and Technology University. The growth speed rate method was used for measuring the antimicrobial spectrum of G-27 owing the optimal bacteriostasis in vitro， and pot trails were carried out to assess its control effect to Cercospora chinensis in vivo. The results indicated that the inhibition rate of strain G-27 fermentation broth to F. acuminatum was 87.67%. Additionally， it had promising antimicrobial effect to over 10 kinds of plant pathogens， for example， Phytophora capsici， indicating it had broad-spectrum antimicrobial effects. The strain G-27 had significant control efficacy（P＜0.05）compared with the pesticides treatments， and the protective and the therapeutic efficacy of the aseptic filtrate of G-27 reached 70.01% and 71.52% with no dilution， even control efficacy of the 20 times dilution of fermentation broth exceeded 50% in pot trails. According to morphologic， physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence analysis， strain G-27 was identified as Bacillus amyloliquefaciens.

Polygonatum odoratum；Fusarium acuminatum；antagonistics；Bacillus amyloliquefaciens；bio-control

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.021

2015-01-27

吉林省教育廳“十二五”科研規劃資助項目［教科合字（2012）301號］

畢博，男，博士研究生，講師，研究方向：藥用植物栽培；E-mail：17470823@qq.com

包京姍，女，研究方向：藥用植物栽培；E-mail：baojingshan@163.com