豬肉中四環素殘留快速檢測法的研究

鮑會梅

（江蘇食品藥品職業技術學院食品與營養工程學院，江蘇淮安223003）

豬肉中四環素殘留快速檢測法的研究

鮑會梅

（江蘇食品藥品職業技術學院食品與營養工程學院，江蘇淮安223003）

對豬肉樣品的四環素殘留量檢測的研究。以高效液相色譜法（HPLC）檢測豬肉組織中四環素殘留，并對這種方法的提取及測定條件等方面進行了探討。確定最佳提取條件是用5%高氯酸溶液25 mL提取樣品中四環素殘留，選擇最佳測定條件是色譜柱為ODS-C18（6.2 mm×15 mm，5 μm），柱溫為35℃，進樣量為10 μL，波長為265 nm，流速為1.0 mL/min。

高效液相色譜法；豬肉；四環素

四環素是四環素類抗生素之一。而四環素類抗生素在化學結構上都屬于氫化駢四苯環衍生物，并且在近可見區（270 nm附近）具有強紫外吸收，干燥條件下四環素族較穩定，但遇光易變色。在弱酸性溶液中相對穩定，在酸性溶液（pH＜2）、中性或堿性（pH＞7）均易發生降解而失效。在酸性條件下，易脫水，消除生成橙黃色脫水物，抗菌活性減弱或完全消失。在堿性條件下，生成具有內酯的異構體［1］。

四環素（Tetracycline，TC），又稱去甲金霉素，分子式為C22H24N2O8，分子量444.45，是從放線菌金色鏈叢菌的培養液等分離出來的抗菌物質。黃色晶體，熔點170℃～175℃。微溶于水、乙醇和丙酮，在空氣中穩定，但易吸收水分，受強日光照射變色。當人體中的四環素含量達到一定量時，可以對人體產生多種急慢性中毒，導致人體多種器官的病變［2］。在我國豬肉組織中四環素殘留量最大限值為0.25 mg/kg［3］。

本文采用高效液相色譜法（HPLC）檢測四環素在豬肉可食組織中四環素殘留量［4］。此方法不僅操作簡便，而且靈敏度和特異性高，可用于動物組織中四環素殘留量的檢測分析。

1　材料與方法

1.1試劑及配置

乙腈（分析純）；0.01 mol/L磷酸氫二鈉溶液；0.01 mol/L草酸甲醇溶液；0.01 mol/L三氟乙酸溶液；0.1 mol/L Na2EDTA-Mclivaine緩沖液平衡（pH=4.0）；四環素（TC）標準貯備液（1 mg/mL）；四環素標準使用液（10 mg/L）；5%高氯酸溶液；5%甲醇溶液。

豬肉：江蘇省淮安市沃爾瑪超市的冷鮮肉。

1.2主要儀器

Agilent1200高效液相色譜儀（HPLC），配有紫外檢測器：美國Agilent公司；32R型離心機：德國HettichUNIVERAL公司；固相萃取裝置：美國Waters公司。

1.3實驗方法

1.3.1色譜條件

色譜柱：ODS-C18（6.2 mm×15 mm，5 μm）；柱溫：30℃；進樣量：10 μL；測波長：265 nm；流速：1.0 mL/min；流動相：乙腈-0.01 mol/L。

1.3.2樣品提取方法的確定

樣品的提取是指用適當的溶劑把待測組分從復雜樣品基質中提取至易于凈化和分析的液體狀態。

1.3.2.1液-液萃取法

液-液萃取法是指被測物的性質在酸或堿性條件下提取凈化［4］。該方法操作簡便，但耗費時間，耗費有機溶劑，并且溶劑中容易引入新的雜質。還有的溶劑的大量揮發對實驗人員健康會造成較大的危害，樣品經多次轉移濃縮會造成的分析誤差較大，回收率較低。

1.3.2.2固相萃取法

固相萃取法是采用選擇性吸附、選擇性洗脫的方式對樣品進行富集、分離、純化。該方法與傳統的液——液萃取法相比，具有明顯的優勢［5］。不僅提高了樣品的處理通量，排除了基質對樣品的影響能力，而且大大減少了溶劑的消耗，回收率高、重現性好，雜質干擾極低，易于實現自動化控制等，是目前獸藥殘留分析樣品前處理中的主流技術。

1.3.2.3微波輔助萃取法

微波輔助萃取法是一種萃取速度快、溶劑用量少、回收率高、靈敏以及易于自動控制的新固態樣品提取技術。該方法在回收率和重復性上優于其他萃取方法，同時不受含水量的影響，但此方法還未普及推廣。

綜合上述得，本文采用固相萃取法對豬肉進行提取為最佳提取方法。

1.3.3樣品的制備

將豬肉切碎，于組織勻漿機中勻漿，備用。

1.3.4樣品的提取

精確稱取絞碎后的豬肉樣品5.000 0 g，置于50 mL離心管中，渦旋，震蕩，加入25 mL Na2EDTA-Mclivaine緩沖溶液提取，搖勻，再加入2 mL 0.01 mol/L三氯乙酸除去蛋白質，均質，以6 000 r/min離心10 min，過濾，再用25 mL Na2EDTA-Mclivaine緩沖溶液提取一次，過濾合并上清液。調上清液的pH至4.0，加入15 mL乙酸乙酯，6 000 r/min離心10 min，取上清液經中性快速濾紙過濾到100 mL錐形瓶中。離心管中殘留物用10 mL Na2EDTA-Mclivaine緩沖液重復提取2次，振蕩10min，在4℃下，以6 000 r/min離心10 min，一并過濾于錐形瓶中［8］。此為備用液，待凈化。

1.3.5樣品的凈化

Oasis HLB固相萃取柱分別用5 mL甲醇、5 mL水預處理，保持柱體的濕潤。再用0.1 moL/L Na2EDTAMclivaine緩沖液平衡，取備用液分次全部過同相萃取柱，待液體全部流出后用10 mL 5%甲醇溶液淋柱，在65 kPa減壓抽干30 min。用10 mL 0.01 mol/L草酸甲醇溶液洗脫，收集洗脫液于錐形瓶中。

1.3.6工作曲線

取7個編號為1、2、3、4、5、6、7的25 mL比色管，分別加入四環素標準使用溶液0、0.125、0.25、0.5、1.25、2.5、5 mL（濃度為0.00、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00mg/L）。用0.01 mol/L草酸溶液定容至刻度。從低濃度到高濃度依次進樣，每個濃度進樣10 μL，以峰面積為縱坐標，以四環素的濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.3.7樣品的測定

將收集在錐形瓶中的洗脫液，將其進行稀釋，使之在曲線濃度范圍內，用0.45 μm濾膜過濾，取溶液10 μL進樣，記錄峰面積，從工作曲線上查得四環素濃度，計算四環素的含量。

1.3.8結果計算

式中：X為試樣中四環素的含量，（mg/kg）；C為標準曲線查得的試液中四環素的濃度，（mg/L）；V為樣品定容體積，mL；m為試樣質量，g。

根據公式和標準曲線圖計算出測定的濃度，再經多次試驗計算出回收率和精密度。

1.3.9豬肉中四環素殘留的檢測條件的探討

在豬肉中四環素殘留的檢測條件不同對高效液相色譜法檢測豬肉中四環素殘留有一定的影響，本文就對樣品的提取方法選擇、檢測波長的選擇、提取液的選擇、提取液pH的選擇等進行討論。

2　結果與分析

2.1豬肉中四環素殘留的檢測結果與分析

2.1.1標準曲線線性范圍

按試驗方法繪制標準曲線結果見表1和圖1。

由圖1得，四環素在0.05 mg/L～2 mg/L的濃度范圍內有良好的線性關系，測定樣品中四環素進樣量的峰面積為262 822，根據圖1得樣品中四環素濃度（Cx）為1.26 mg/L。根據2.3.8公式計算樣品中四環素的含量為0.126 mg/kg。

表1　四環素的進樣量與峰面積Table 1The sample size and peak area of tetracycline

圖1　標準曲線圖Fig.1Standard diagram

2.1.2精密度試驗

分別稱取7份絞碎后的豬肉樣品，在相同的檢測條件下，根據上述樣品測定方法在同樣的條件下進行多次平行試驗，實驗結果如表2。

表2　精密度試驗結果Table 2Results of precision test

通過對同一樣品的重復性實驗對該測定方法的精密度進行檢測，實驗結果表明其檢測重復性好，精密度高，變T（min）、異系數分別為0.073%，0.83%，因此該精密度符合要求。

2.1.3樣品回收率實驗

采用標準加入法進行試驗。在豬肉樣品中添加一定量的四環素標準使用液進行回收率試驗，實驗結果如表3。

由表3可知：豬肉中四環素的平均回收率為91.1%。符合動物性食品中獸藥殘留試驗技術規范和要求，所以該方法是可行的。

表3　豬肉中四環素的回收率試驗結果Table 3Recovery of tetracycline from pork and the results of the test

2.2提取條件的探討

2.2.1提取液的選擇

稱取同一份豬肉組織5.000 0 g，加入10 μg/mL的標準溶液50 μL，渦旋混勻后，分別加入Na2EDTAMclivaine緩沖液、5%高氯酸溶液、0.01mol/L草酸甲醇溶液3種不同提取液提取，把它們從固相萃取柱上洗脫下來。計算回收率，四環素的回收率見表4。

表4　提取液的選擇Table 4Selection of extracts

由表4可見，在相同的條件下，Na2EDTA-Mclivaine緩沖液的提取率高于5%高氯酸溶液和0.01 mol/L草酸甲醇溶液提取液提取率，因此，采用Na2EDTAMclivaine緩沖液作為提取液。

2.2.2提取液pH的選擇

以豬肉為考察對象，使用3種不同pH（3.0、4.0、5.0）的Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液的回收率試驗，結果見表5和圖2。

表5　提取溶液pH對四環素提取回收率的影響Table 5The effect of pH value of extraction solution on the recovery of tetracycline

圖2　提取溶液pH的選擇Fig.2The selection of the pH value of the solution

從表5和圖2看出，在相同的條件下，在pH=4.0時，四環素回收率達到最大。故確定用pH=4.0的Na2EDTA-Mclivaine緩沖容液為提取液，溶液中的Na2EDTA能夠掩蔽金屬離子的干擾。

2.3色譜條件的最佳選擇

2.3.1檢測波長的選擇

四環素分子內含有共軛雙鍵系統，在紫外區有吸收，四環素在270 nm附近有較強的吸收，為了確定四環素的檢測波長，對其200 nm～450 nm進行光譜掃描，四環素的紫外光譜掃描圖見圖3。

圖3　四環素紫外-可見光譜圖Fig.3Tetracycline UV Vis

從圖3掃描圖譜可以看出，四環素在220、235、265nm和355nm處有4個吸收峰，而在色譜測定中發現，在265 nm波長處，四環素的響應較大，吸收強度最好，即四環素的最佳波長為265nm，故本文采用265nm。

2.3.2柱溫的選擇

因為柱溫太高，導致四環素差向異構化形成差向四環素；柱溫太低，導致流動相粘度大，造成色譜峰拖尾，當柱溫為25、30、35℃時進行色譜測定，結果見圖4。

圖4　四環素在不同的柱溫條件下的色譜圖Fig.4The chromatogram of tetracycline under different column temperature conditions

當柱溫為40℃時，四環素差向異構化形成差向四環素，所以本文不選擇柱溫為40℃。由圖4知：當柱溫為35℃時，四環素的色譜峰沒有拖尾故，本試驗柱溫選擇35℃。

2.3.3流動相pH對分離效果的影響

分別配制pH=7.0，pH=4.0，pH=2.5的乙腈-0.01 mol/L磷酸二氫鈉溶液的pH，觀察不同的流動相對四環素和其他雜質的分離效果的影響，結果見表6。

表6　流動相pH對分離效果的影響Table 6The effect of mobile phase pH on separation effect

由表6知，pH=7.0和pH=4.0的情況下，四環素和其他雜質的分離效果不好，色譜柱對抗生素有較強的吸附作用，因此選擇流動相的pH為2.5。

2.3.4流速的選擇

流速大小直接影響色譜柱及其系統壓力、各組分的分離時間。流速太慢，洗脫時間太長；流速太快，柱壓太高，容易引起柱頭塌陷，不利于色譜柱的長期使用。在流速分別為：1.0、1.5、2.0 mL/min時，流速對四環素洗脫時間、柱壓的影響，結果見表7和圖5，以確定最佳流速。

表7　流速對四環素洗脫時間、柱壓的影響Table 7Effects of flow velocity on the elution time and column pressure of tetracycline

圖5　流速對四環素洗脫時間、柱壓的影響Fig.5The effect of flow velocity on the elution time and column pressure of tetracycline

由圖5表明，當流速為1.0 mL/min時分離效果最佳。

3　結論

通過建立了高效液相色譜法（HPLC）檢測豬肉組織中四環素殘留的方法。最終得出以下結論：用5%高氯酸溶液25 mL提取樣品中四環素殘留，經0.1 mol/L Na2EDTA-Mclivaine緩沖液，0.01 mol/L草酸甲醇溶液凈化。以乙腈0.01 mol/L磷酸二氫鈉溶液（30%硝酸溶液調節pH2.5）75∶25為流動相，色譜柱為ODS-C18（6.2 mm×15 mm，5 μm，柱溫為35℃，進樣量為10 μL，測波長為265 nm，流速為1.0 mL/min。通過實驗可知，本文建立一種方法簡便、快速、重復性好、準確度高的高效液相色譜法，是豬肉中四環素殘留快速檢測的有效方法。本方法對樣品前處理方法進行改進，使各色譜峰避免受雜質峰的干擾，得到良好的分離，保留時間穩定，線性范圍好，能滿足豬肉中四環素殘留檢測的分析要求，具有實際應用價值。

［1］岳振峰，鄭衛平，謝麗琪，等.高效液相色譜法測定動物組織中四環素類抗生素殘留量的研究［J］.分析實驗室，2006（10）：24

［2］吉彩霓，岳振峰，謝麗琪，等.高效液相色譜法同時檢測水產品中7種四環素類抗生素殘留的研究［A］.中國獸醫科技，2005，35（10）：820

［3］尹凱丹，張奇志.食品理化分析［M］.北京：化學工業出版社，2008：228-229

［4］丁明潔，張春暉.儀器分析［M］.北京：化學工業出版社，2010：93

［5］中國國家標準化管理委員會.GB/T 5009.116-2003畜、禽肉中土霉素、四環素、金霉素殘留量的測定（高效液相色譜法）［S］.北京：中國標準出版社，2003，50-229

［6］中國國家標準化管理委員會.GB/T20764-2006可食動物肌肉中土霉素、四環素、金霉素、強力霉素殘留量的測定（液相色譜-紫外檢測法）［S］.北京：中國標準出版社，2006：6-22

［7］陳薔.動物源食品中四環素類抗生素殘留高效液相色譜檢測方法的研究［J］.河南農業大學，2009（5）：33

Pork in Tetracycline Residues Rapid Detection Method Research

BAO Hui-mei
（Jiangsu Food Vocational Technical College of Engineering Food and Nutrition，Huai'an 223003，Jiangsu，China）

Based on the high performance liquid chromatography（HPLC）detection of tetracycline residues in pork tissue，and the methods of extraction and determination conditions were discussed.To determine the optimal extraction conditions for 5%perchloric acid solution 25 mL extraction samples tetracycline residues，and the optimal conditions for the determination was a chromatographic column for ODS-C18（6.2 mm×15 mm，5 μm，35℃），column temperature，amount of sample was 10 μL，265 nm wavelength，the flow rate of 1.0 mL/min，the experimental detection of pork samples study on the residues of tetracycline.

high performance liquid chromatography；pork；tetracycline

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.13.030

2013-12-12

鮑會梅（1974—），女（漢），副教授，碩士，主要從事食品理化檢驗教學工作。