滸苔多糖脫蛋白工藝的考察

唐志紅，王藝，馬紅婷，溫少紅，秦松，*

（1.煙臺大學生命科學學院，山東煙臺264005；2.中國科學院煙臺海岸帶研究所，山東煙臺264003）

滸苔多糖脫蛋白工藝的考察

唐志紅1，王藝2，馬紅婷1，溫少紅1，秦松2，*

（1.煙臺大學生命科學學院，山東煙臺264005；2.中國科學院煙臺海岸帶研究所，山東煙臺264003）

研究滸苔多糖的脫蛋白方法與工藝。以蛋白脫除率和多糖損失率作為為指標比較三氯乙酸（TCA）法、Sevag法、酶法及酶-Sevag法脫蛋白的效果。結果表明：酶-Sevag法脫蛋白效果較好，其最佳工藝條件為：酶用量3%，酶解時間3 h，酶解溫度45℃，pH 5.0，Sevag法脫蛋白次數2次，在此條件下，蛋白質脫除率和多糖損失率分別為89.73%和27.46%。酶-Sevag法是去除滸苔粗多糖中蛋白質較理想的方法，該優化工藝可用于滸苔粗多糖的脫蛋白。

滸苔；多糖；脫蛋白

滸苔（Enteromorpha prolifera）是一種較為常見的大型綠藻，俗稱苔菜、苔條等，具有重要的食用和藥用價值。滸苔中含有豐富的糖類、粗纖維、蛋白質及礦物質，同時還含有維生素和脂肪［1］。其中所含的水溶性多糖具有較強的生物學活性，具有抗菌、抗病毒、降血脂、抗氧化及增強免疫力等藥理活性，有著重要的開發價值和廣闊的應用空間［2-6］。目前對滸苔多糖的提取多采用熱水浸提法，而用熱水提取的多糖，常含有較多的蛋白質，因此，盡可能多地去除蛋白質而保留多糖成為多糖純化的一個重要環節，同時也是提高產品生物活性的有效方法［7］。本實驗以多糖損失率和蛋白質去除率為考察指標，對滸苔多糖的脫蛋白方法進行了考察。

1材料與方法

1.1材料與試劑

滸苔：購于山東青島；木瓜蛋白酶：鄭州康源化工產品有限公司；無水乙醇、苯酚、三氯乙酸、濃鹽酸、氯仿、正丁醇、濃硫酸、葡萄糖等試劑均為國產分析純。

1.2儀器與設備

HP-8453紫外可見分光光度計：惠普公司；DZKW-4電子恒溫水浴鍋：上海金橋科技儀器廠；LXJ－ⅡB低速大容量多管離心機：上海安亭科學儀器廠；AR-1104電子天平：奧克斯國際貿易上海有限公司。

1.3方法

1.3.1工藝流程

滸苔粉末→熱水浸提（80℃浸提3 h，2次）→離心→上清液真空濃縮→乙醇沉淀→沉淀物溶于水→脫蛋白→滸苔多糖

1.3.2多糖含量測定

采用苯酚-硫酸法［6］，以葡萄糖作標準曲線測定多糖含量。樣品中多糖損失率按以下公式計算。

式中：A0為粗多糖溶液中多糖的百分含量；Ax為脫蛋白后多糖溶液中多糖的百分含量。

1.3.3蛋白質含量測定

采用考馬斯亮藍G-250法［8］，以牛血清蛋白作標準曲線測定蛋白質含量。蛋白質脫除率按以下公式計算。

式中：P0為粗多糖溶液中蛋白質的百分含量；PX為脫蛋白后多糖溶液中蛋白質百分含量。

1.3.4脫蛋白

1.3.4.1三氯乙酸（TCA）法脫蛋白［9］

取粗多糖濃縮液稀釋50倍，加入質量濃度不等的TCA，混勻，于4℃冰箱靜置過夜，4 000 r/min離心10 min，取上清液，測定多糖和蛋白質的含量。

1.3.4.2Sevag法［10］

在粗多糖溶液中加入0.20倍體積的氯仿和0.04倍體積的正丁醇，反應30min，經離心去除沉淀后，測定上清液中蛋白質含量。將上清液重復以上脫蛋白步驟。

1.3.4.3酶法

在單因素實驗的基礎上，選取酶用量、時間、溫度、pH為主要因素，進行L9（34）正交試驗，以蛋白質的脫除率、多糖保留率為考察指標，確定最佳的脫蛋白條件。因素水平見表1。

表1　酶法脫蛋白正交試驗因素水平Table 1Factors and levelst in the orthogonal test of enzyme deproteinization

1.3.4.4酶-Sevag法脫蛋白

按照酶法脫蛋白質的最佳條件，稱取一定量的木瓜蛋白酶與粗多糖液混勻除蛋白，置于80℃恒溫振蕩器中振蕩使蛋白酶失活，冷卻至室溫，然后按“1.3.4.2”進行Sevag法處理。

2結果與分析

2.1三氯乙酸（TCA）法

TCA法對滸苔多糖的脫蛋白結果見圖1。

圖1　三氯乙酸法（TCA）對蛋白脫除率和多糖損失率的影響Fig.1Effect of TCA concentration on protein removal and polysaccharide loss

TCA脫蛋白質量濃度在1 g/100 mL～6 g/100 mL時，蛋白脫除率明顯提高，超過6 g/100 mL時，蛋白質脫除率會有所下降。綜合多糖損失率和蛋白脫除率分析，確定三氯乙酸最佳質量濃度6 g/100 mL，此時蛋白脫除率62.39%，多糖損失率31.82%。

2.2Sevag法脫蛋白效果

Sevag法脫蛋白質次數對蛋白脫除率和多糖損失率的影響如圖2所示。

圖2　Sevag法脫蛋白質次數對蛋白脫除率和多糖損失率的影響Fig.2Effect of Sevag deproteinization times on protein removal and polysaccharide loss

隨著Sevag法脫蛋白次數的增加，粗多糖溶液中蛋白質的脫除率逐漸增加，經過3次脫蛋白處理之后增加趨勢稍減弱，經過3次脫蛋白處理后，蛋白質脫除率為75.80%；隨著處理次數的增加，糖液中多糖的損失也增加，5次脫蛋白處理后多糖損失率達43.31%。

2.3酶法脫蛋白

選取酶用量、酶解時間、酶解溫度、pH 4個因素，進行L9（34）正交試驗，結果見表2。

對試驗數據采用綜合加權評分法評分，權重系數均為0.5，分別將2項指標的最大數定為100分，其他各組合按下式評分：綜合評分=（蛋白質脫除率/78.62）×100×0.5+（1-多糖損失率/1-11.25）×100×0.5。由表2可見，4個因素對脫蛋白的影響程度為：A＞D＞B＞C。最優工藝條件是A2B3C1D2，即酶用量3%，時間3 h，溫度45℃，pH5，按照工藝條件A2B3C1D2進一步作驗證試驗（3次平行試驗），蛋白質脫除率平均達82.65%，多糖損失率平均達20.37%。

表2　酶法脫蛋白正交試驗結果Table 2Results of orthogonal test for enzyme method deproteinization

2.4酶-Sevag法脫蛋白

酶-Sevag法脫蛋白結果見圖3。

圖3　酶-Sevag法脫蛋白的效果Fig.3Deproteinization effects of Enzyme-Sevag method

從圖3可以看出，當使用酶法優化條件后處理粗多糖溶液后，接著使用Sevag法脫蛋白2次，蛋白脫除率達到最高，之后增加處理次數脫蛋白率沒有明顯的增加，而多糖損失明顯上升。故確定酶-Sevag聯合法的最佳工藝為酶用量3%，時間3 h，溫度45℃，pH 5，用Sevag法處理2次，蛋白脫除率可達到89.73%，多糖損失率27.46%。

2.54種脫蛋白方法的比較

三氯乙酸（TCA）法、Sevag法、酶法及酶-Sevag法脫蛋白4種方法對滸苔粗多糖的脫蛋白效果見表3。

表3　4種方法脫蛋白的效果Table 3Comparison of different methods of deproteinization

采用TCA法脫蛋白時條件劇烈，其原理是與大分子蛋白質結合成不溶性鹽，從而使蛋白沉淀下來，TCA的質量濃度對脫蛋白效率有較大影響，但當蛋白結構較復雜和致密時，TCA難以滲入內部，使蛋白無法完全沉淀，從表3中可看出TCA法的蛋白脫出率最低。采用Sevag法去除蛋白質時，會將少量黏附的多糖一同除去，造成多糖損失，次數越多，損失也會越多，因此Sevag法多糖損失較為嚴重。酶法是除蛋白較溫和且高效的一種方法，有利于保持多糖的活性，但在酶解時產生的多肽會游離于水中，降低酶法的蛋白脫除效率，將酶法與Sevag法結合，由于酶可水解下蛋白質，使結合在多糖上的蛋白游離出來，引起Sevag法的蛋白沉淀率增大，近年研究也表明酶-Sevag聯合法脫蛋白效率高，可以大大減少后續Sevag試劑的使用次數，多糖損失率也較單用Sevag法時降低［11］。

3結論

本實驗采用蛋白脫除率和多糖損失率為評價指標，對滸苔多糖的脫蛋白方法進行了篩選，比較4種方法對滸苔粗多糖溶液脫蛋白的效果，綜合來看，酶-Sevag法效果最好，蛋白質脫除率最高，多糖損失率較低，試劑用量小，樣品損耗少。事實上，不論是采用單一的方法還是采用酶-Sevag法，多糖溶液中仍會有少量蛋白質與多糖牢固結合形成了多糖蛋白質復合物，要想獲得更純的多糖制品，還需要經過其他一系列的精制工藝。

［1］吉宏武，趙素芬.南海3種可食綠藻化學成分及其營養評價［J］.湛江海洋大學學報，2005，19（3）：19-23

［2］Vlachos V，Critchley AT，A von Holy.Antimicrobial activity of extracts from selected Southern African marine macroalgae［J］.South African Journal of Science，1997，93（7）：328-332

［3］Hudson J B，Kim J H，Lee M K，et al.Antiviral compounds in extracts of Korean seaweeds：Evidence for multiple activities［J］.Journal of Applied Phycology，1999，10（5）：427-434

［4］許晶晶，唐志紅，王景玉，等.滸苔多糖的純化及抗氧化活性研究［J］.食品工業科技，2009，30（10）：134-137

［5］林文庭.淺論滸苔的開發與利用［J］.中國食物與營養，2007（9）：23-25

［6］唐志紅，于志超，趙巍，等．滸苔多糖超聲波提取工藝的研究［J］.現代食品科技，2011，27（1）56-59

［7］王克俊，王麗琴.敗醬草多糖的脫蛋白研究［J］.藥學實踐雜志，2010，28（6）：429-430

［8］李艷輝，魯巍巍，官艷麗，等.玉竹多糖脫蛋白方法的比較研究［J］.時珍國醫國藥，2011（9）：2127-2128

［9］朱潔平，李峰，沈業壽.亮菌菌索多糖脫蛋白方法研究［J］.安徽農業科學，2011，39（19）：11443-11444

［10］周寶珍，肖婭萍.絞股藍多糖脫蛋白工藝及相對分子質量的測定［J］.陜西師范大學學報（自然科學版），2012，40（1）：63-66

［11］劉莉，李泳怡，潘育方.荔枝核多糖脫蛋白工藝考察［J］.中國實驗方劑學雜志，2012，23（12）：52-55

Investigation of Deproteinized Technology for Polysaccharide from Enteromorpha Prolifera

TANG Zhi-hong1，WANG Yi2，MA Hong-ting1，WEN Shao-hong1，QIN Song2，*
（1.College of Life Science，Yantai University，Yantai 264005，Shandong，China；2.Yantai Institute of Coastal Zone Research，Chinese Academy of Sciences，Yantai 264003，Shandong，China）

The method was investigated to remove protein from polysaccharide of Enteromorpha prolifera.-The effect of deproteinization with different methods such as TCA，Sevag，enzyme，and enzyme-Sevag method was evaluated in terms of the ratio of protein removal and polysaccharide loss.The result showed that enzyme-Sevag method was better than others with the higher protein removal.The optimum technological conditions of deproteinization were：enzyme usage 3%，time 3 h，temperature at 45℃，pH5.0，and Sevag deproteinization 2 times.After treatment with optimum conditions，the ratio of deproteinization and polysaccharide loss were 89.73%and 27.46%，respectively.Enzyme-Sevag method is effective and alternative and can be used for removing protein from polysaccharide of Enteromorpha prolifera.

Enteromorpha proliferate；polysaccharides；deproteinization

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.11.022

2013-12-03

山東省高等學校科技計劃項目（J11LF71）

唐志紅（1974—），女（漢），副教授，博士，研究方向：海洋生物活性物質。