益智油的超聲法提取工藝優(yōu)化及成分分析

陳俊，李云飛，馬華林，王丹，陳文學(xué)

（海南大學(xué)食品學(xué)院，海南海口570228）

益智油的超聲法提取工藝優(yōu)化及成分分析

陳俊，李云飛，馬華林，王丹，陳文學(xué)*

（海南大學(xué)食品學(xué)院，海南海口570228）

益智是一種名貴中藥，從中提取得到的益智油具有抗氧化作用。以石油醚作為提取溶劑，采用超聲波輔助提取法得到益智油，DPPH（二苯代苦肼基自由基）法測定其抗氧化能力，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）對其進行成分分析。以得油率為指標，超聲時間、溫度、料液比進行單因素實驗，再運用正交設(shè)計對其提取條件進行優(yōu)化。結(jié)果表明，超聲法提取益智油的最佳條件為超聲時間75 min、溫度35℃、料液比4.5 mL/g，在此條件下，得油率可達3.63%；經(jīng)抗氧化能力測定，超聲波法提取的益智油具有較好的抗氧化能力；經(jīng)成分分析，益智油中主要含萜類等抗氧化活性成分。

益智；超聲法；抗氧化；成分

益智（Alpinia oxyphylla Miq.）為多年生熱帶姜科植物，我國衛(wèi)生部公布的既是藥品又是食品的植物資源之一［1］，主產(chǎn)于海南、廣東。其干燥成熟果實——益智仁，具有治療脾胃虛寒、腹中冷痛、口多唾涎、腎虛遺尿等多種功效［2］。現(xiàn)代研究表明益智具有強心、鎮(zhèn)靜、抗驚厥、抗衰老等作用［3］；另一研究結(jié)果顯示益智油對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌等常見致病菌的生長具有抑制作用［4］。益智油，主要是存在于益智仁等部位中的一類具有芳香氣味、與水不相混溶的油狀混合物。此類植物精油可作為重要的調(diào)香原料，還具有各種生物活性，在食品、醫(yī)學(xué)等方面可得到應(yīng)用［5］。日本早在20世紀20年代就已經(jīng)開始研究益智油，國內(nèi)的研究早期較少，近年來，為了加快海南益智藥材資源的開發(fā)，我國研究人員對益智也進行了較系統(tǒng)的研究。

利用超聲波強化浸取和萃取過程是超聲波化學(xué)領(lǐng)域中極具潛力的發(fā)展方向。在提取過程中引入超聲波，利用超聲對細胞的機械效應(yīng)、空化效應(yīng)和熱效應(yīng)，就可以在較低的溫度下大大促進溶劑提取天然成分的過程［6］。近年來，益智油的提取分析一直是科學(xué)研究的熱點。隨著社會的進步與發(fā)展，人民生活水平的提高，新的、快速的、高效的提取方法的出現(xiàn)已成為趨勢，這對提取益智油并保證其穩(wěn)定性提出了更高要求。

1材料與方法

1.1材料與儀器

中藥益智仁產(chǎn)于海南省瓊海市；石油醚分析純，60℃～90℃沸程，廣州光華科技有限公司；無水乙醇分析純，純度≥99.7%，廣州光華科技有限公司；抗壞血酸分析純，純度≥99.7%，天津市天新精細化工開發(fā)中心；DPPH生物試劑，美國Sigma公司。

HP6890/5973MSD氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Hewlett-Packark公司；WF-300EH超聲波清洗儀：寧波海曙五方超聲設(shè)備有限公司；DHG-9075A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Evolution300 BB型分光光度計：美國Thermo fisher。

1.2氣相色譜條件

石英毛細管柱HP-624（30 m×0.25 mm，1.40 μm），程序升溫：從80℃開始，以10℃/min升到200℃，再以6℃/min升到250℃，保持10 min；載氣為He，柱流量1.0 mL/min，進樣口溫度250℃，分流比50∶1。質(zhì)譜條件：EI源；電離電壓70 eV，離子源溫度230℃，掃描范圍10 u～500 u，進樣量1.0 μL。

1.3標準溶液的配制

取DPPH標準樣品20.00 mg，用無水乙醇定容至100 mL，配成0.000 2 g/mL的DPPH標準溶液，置于0℃～4℃冰箱中保存。

1.4樣品處理

益智仁于50℃烘箱中放置24 h，冷卻后破碎成粉末，過40目篩，干燥器中常溫保存。

1.5試驗方法

1.5.1單因素及正交試驗

取益智仁粉末30.00 g，加入提取溶劑，保鮮膜封口，在固定其他條件不變的情況下進行超聲波輔助提取的單因素實驗，研究液料比、超聲提取時間、提取溫度對得油率的影響［7］。確定單因素后進行正交試驗。

1.5.2自由基體外清除試驗

取適量提取的益智油用無水乙醇稀釋成2、4、6、8、10 mg/mL溶液，各2 mL備用，分別加入DPPH標準溶液2 mL后于室溫避光反應(yīng)30 min，在517 nm處測定吸光度值［8］。蒸餾水做空白對照，3次平行試驗，計算清除率。

式中：A1為2 mL樣品溶液+2 mL DPPH溶液；A2為2 mL樣品溶液+2 mL無水乙醇；A3為2 mL無水乙醇+2 mL DPPH溶液。

2結(jié)果與討論

2.1單因素試驗

2.1.1液料比對得油率的影響

超聲波頻率40 kHz，提取時間30 min，溫度50℃，設(shè)置液料比2 mL/g～7 mL/g，研究液料比對益智得油率的影響見圖1。

圖1　液料比對得油率的影響Fig.1 Effect of material/liquid ratio on Alpinia oxyphylla oil extracted rate

當液料比在2 mL/g～5 mL/g時，益智得油率隨液料比的增加而增加，從1.723%上升到2.753%，這是因為溶劑用量的增加會增大益智仁粉末與溶劑接觸面，從而提高了精油與溶劑的擴散速度，得油率增大［9］；當液料比為6 mL/g時，得油率下降為2.689%，7 mL/g時為2.390%，即從5 mL/g增加后，得油率隨液料比的增加而有所下降。

2.1.2提取時間對得油率的影響

超聲波頻率40 kHz，溫度50℃，液料比5 mL/g，設(shè)置提取時間30 min～150 min，研究提取時間對油得率的影響見圖2。

圖2　超聲提取時間對得油率的影響Fig.2Effect of ultrasonic time on Alpinia oxyphylla oil extracted rate

當時間由30 min增加到60 min時，得油率隨時間的延長而增加，從2.755%增至2.893%，這是因為隨時間增加，益智中的藥效物質(zhì)在超聲波場作用下分子運動加劇［10］；但由60 min增至150 min時，得油率一直呈下降趨勢，150 min時只有2.632%，此時藥效物質(zhì)的運動速度已增大到極致，同時，一些揮發(fā)性成分逐漸逸出，加之精油降解等因素，使得得油率下降。

2.1.3提取溫度對益智油得率的影響

超聲波頻率40 kHz，提取時間60 min，液料比5 mL/g，設(shè)置提取溫度30℃～70℃，研究提取溫度對益智仁油得率的影響見圖3。

圖3　超聲溫度對得油率的影響Fig.3Effect of ultrasonic temperature on Alpinia oxyphylla oil extracted rate

當溫度在30℃～40℃范圍內(nèi)，益智油得率隨溫度增加而增加，從2.573%增到2.831%，因為隨溫度增加，分子運動加劇，精油與溶劑的擴散速度增加［11］，此后升至50℃，只增到2.834%，可能是擴散速度達到平衡，得油率變化不大。之后在50℃～70℃范圍內(nèi)，呈下降趨勢，到70℃時為2.474%，主要原因是益智油中的揮發(fā)成分隨溫度升高逸出。

2.2正交分析結(jié)果

以單因素試驗為依據(jù)，選取對超聲波法進一步進行優(yōu)化，進行L9（34）正交試驗，結(jié)果見表1。

表1　試驗設(shè)計及結(jié)果Table 1Experimental design and results

由表1可知，影響超聲波提取的主要因素：時間＞液料比＞溫度。最佳提取條件為A1B3C1，即液料比4.5mL/g、提取時間75 min、提取溫度35℃。按照最佳條件進行驗證試驗，益智仁得油率可達3.63%。

2.3抗氧化試驗

抗氧化試驗見圖4。

圖4　抗氧化實驗結(jié)果Fig.4The result of antioxidant experiment

抗氧化能力用自由基清除率表示，清除率越大，物質(zhì)的抗氧化能力越強［12］，由圖4可知，VC溶液在2 mg/mL～10 mg/mL范圍內(nèi)對DPPH的清除率持續(xù)保持在85%以上，變化不顯著，表面即使低濃度的VC溶液也具有很強的清除能力；而益智油的自由基清除率則隨其濃度的增大呈增長趨勢，清除率最小為73.66%，最大可達88.62%，說明益智油也具有較強清除能力，且益智油濃度越高，清除能力越強。

2.4超聲波提取油成分分析結(jié)果

超聲波提取油成分分析結(jié)果見圖5。

圖5　益智油GC-MS分析的總離子流圖Fig.5GC-MS analysis of the total ion current of Alpinia oxyphylla oil

由GC-MS分析圖（圖5）可看出，出峰時間從7.0 min～10.5 min區(qū)間為空白，說明益智油的沸點較高，高溫下不穩(wěn)定，易裂解，在分析時有損失［13］。

由分析結(jié)果可知，超聲法提取的益智油中化合物含量較高的有圓柚酮（即諾卡酮，含量21.96%）、1，2，3，5，6，7，8，8a-八氫-1，8a-二甲基-7-（1-甲基乙烯基）-萘（含量19.11%）、α-長葉蒎烯（含量7.45%）、2，6-二-叔丁基-苯醌（含量6.03%）。其中，圓柚酮屬于雙環(huán)倍半萜酮類，具有柑橘果香，強抗氧化性，在用不同方法提取的益智油中均有很高含量［14］，另有實驗證明，益智油中圓柚酮等成分的相對含量較高，清除DPPH等抗氧化活性較好［15］，可認為是益智藥材的有效成分之一。

采用GC-MS分析超聲提取的益智揮發(fā)油，主要得到萜類及其含氧化合物，與相關(guān)文獻相似［16-17］，其中包括可巴烯、欖香烯、蒎烯、莰烯、圓柚酮、蒈烯、喇叭茶醇等十余種。此外，還含有烯類、芳香族化合物及其衍生物、環(huán)氧化物、醛酮類、烷烴類、脂肪酸等物質(zhì)，與相關(guān)報道基本一致［18］。經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析各成分具體如表2。

據(jù)有關(guān)文獻報道，目前可從益智中分離得到的化學(xué)成分主要有5大類：萜類化合物、甾醇類化合物、二苯庚烷類、黃酮類化合物和酚類化合物［19］。其他有益成分包括可溶性糖、脂肪酸、多種維生素、蛋白質(zhì)以及胡蘿卜素等，同時含有人體所需的16種氨基酸，多種微量元素，如鈣、鐵、鋅等［20］。由此可以看出，益智的食用、藥用開發(fā)價值巨大。近年來隨著提取方法的不斷優(yōu)化，每一次研究都會發(fā)現(xiàn)新的或首次分離的化合物，如最近有研究發(fā)現(xiàn)新的降倍半萜類成分——益智酮E、F［21］等新化合物。但這些與功效相關(guān)的藥效物質(zhì)還沒有明確，因此益智的化學(xué)成分還有待更系統(tǒng)、深入地研究，仍有必要進一步加強相應(yīng)的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用開發(fā)。

表2　益智油化學(xué)成分Table 2The chemical compositions of Alpinia oxyphylla oil

3結(jié)論

通過單因素試驗及正交分析，確定了益智油用超聲波提取的最佳工藝條件為：液料比4.5 mL/g、超聲時間75 min、溫度35℃。以該優(yōu)化條件對益智油進行提取，得油率可達3.63%，較優(yōu)化前有較大提高。試驗表明，超聲法提取的益智油表現(xiàn)出較好的清除DPPH能力，清除率均為70%以上。通過成分分析，益智油含有萜類、烯類、芳香族化合物等抗氧化活性成分。

益智主產(chǎn)海南，資源豐富，又有抗氧化作用，因此可從中尋找安全可靠的高效天然抗氧化劑，用于果蔬及食品加工、保鮮貯藏等。益智含有許多生物活性組分，具有許多生理、藥理功能，在食品、醫(yī)藥領(lǐng)域的開發(fā)應(yīng)用有廣闊前景。

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Processing Optimization of Ultrasound-assisted Extraction and Composition Analysis of the Oil from Alpinia oxyphylla

CHEN Jun，LI Yun-fei，MA Hua-lin，WANG Dan，CHEN Wen-xue*
（College of Food Science and Technology，Hainan University，Haikou 570228，Hainan，China）

Alpinia oxyphylla is a valuable medicine，and the oil extracted from it has antioxidant properties. Petroleum ether was used as extraction solvent to extract oil from Alpinia oxyphylla by ultrasound-assisted method as well as the antioxidant capacity of the oil was tested by DPPH.Ingredients were performed by gas chromatography-mass spectrometry analysis（GC-MS）.Using the extracted rate of oil as an index，extraction time and temperature，material/liquid ratio were investigated with single-factor test，then its optimum extraction conditions were optimized by orthogonal designs.The results showed that the optimum conditions for ultrasoundassisted extraction were extraction time of 75 min，extraction temperature of 35℃，material/liquid ratio of 4.5 mL/g.Under these conditions，the extracted rate was up to 3.63%.According to tests，the oil showed strong antioxidant capacity.By composition analysis，the oil contains terpenoids and other active ingredients.

Alpinia oxyphylla；ultrasonic method；antioxidant；ingredients

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.11.009

2013-12-09

海南省自然科學(xué)基金（312073）；海南大學(xué)科研啟動基金（kyqd1224）；海南大學(xué)學(xué)生科研基金；2013年國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（201210589010）

陳俊（1992—），男（漢），本科生，研究方向：食品科學(xué)與工程。