rhIL-1α、1，25-（OH）2D3對人牙周膜成纖維細胞表達RANKL和OPG的影響研究

許 寧 萬英明

（吉林醫藥學院附屬醫院口腔科，吉林 吉林 132013）

rhIL-1α、1，25-（OH）2D3對人牙周膜成纖維細胞表達RANKL和OPG的影響研究

許 寧 萬英明

（吉林醫藥學院附屬醫院口腔科，吉林 吉林 132013）

目的 研究rhIL-1α、1，25-（OH）2D3對人牙周膜成纖維細胞表達RANKL和OPG的影響。方法 將人牙周膜成纖維細胞分別放在含有純培養液、含rhIL-1α培養液、含1，25-（OH）2D3培養液和含有rhIL-1α、1，25-（OH）2D3聯合培養基中培養，并分別標記為D組、A組、B組和C組，培養48 h后，用熒光定量RT-PCR技術檢驗。結果 A組培養基中細胞表達RANKL和OPG均有上升，且RANKL/OPG比值也增加；B組培養基中細胞表達RANKL上升，但OPG下降，RANKL/OPG比值下降；C組培養基中RANKL上升，但對RANKL/OPG無明顯影響。結論 rhIL-1α、1，25-（OH）2D3對人牙周膜成纖維細胞表達RANKL和OPG有較大影響，且rhIL-1α、1，25-（OH）2D3聯合使用時對RANKL起到了協同作用。值得臨床進一步探究。

rhIL-1α；1，25-（OH）2D3；人牙周膜成纖維細胞；表達RANKL和OPG；影響

近年來，越來越多的人選擇進行固定修復及牙齒矯正。固定修復中基牙穩定性與牙周膜質量密切相關，而牙齒矯正就需要牙槽骨的改建，此改建過程極為復雜，除了成骨、破骨細胞的參與外，還有許多牙周膜成纖維細胞也起到了重要作用［1］。人牙周膜成纖維細胞依靠著表達RANKL和OPG來影響骨細胞的活動，二者為破骨細胞的終末因子，調控著破骨細胞的分化、激活和成熟。近期研究發現rhIL-1α、1，25-（OH）2D3與人牙周膜成纖維細胞表達RANKL和OPG有一定的關系。因此，筆者通過研究rhIL-1α、1，25-（OH）2D3對人牙周膜成纖維細胞表達RANKL和OPG的含量調節來為進一步進行牙齒矯正及固定修復提供更加合理的方法。報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料：此次試驗所需要的儀器有Trizol試劑（由康為世紀股份有限公司提供）、氯仿（由淄博卓凱經貿有限公司提供）、乙醇（由國藥集團化學試劑有限公司提供）、RT-PCR試劑盒（上海譜振生物科技有限公司提供）、SYBR熒光染料（由華美瑞康國際生物技術研究中心提供）、DEPC（上海如吉生物科技發展公司提供）、引物（由國藥集團化學試劑有限公司提供）、10 μg/L rhIL-1α、1×10-8mol/L 1，25-（OH）2D3等。

1.2 人牙周膜成纖維細胞的培養與鑒定：培養材料均來自于臨床上12歲左右青少年因正畸需要拔除的第一或第二前磨牙，且牙齒無任何損傷及其他疾病。將牙體放入培養液中，采用組織塊培養法將組織與細胞分離，培養液每3 d更換一次。取第三代人牙周膜成纖維細胞進行標記和染色，對細胞進行鑒定。將4～7代人牙周膜成纖維細胞作為實驗材料。實驗過程中按照合適的密度將細胞培養在65 cm2的培養基中，觀察細胞的生長和貼壁情況。代細胞完全貼壁后，吸取原有培養液，按分組進行誘導刺激，A組內加入rhIL-1α，B組內加入1，25-（OH）2D3，C組內加入rhIL-1α、1，25-（OH）2D3，D組不加入任何試劑，培養48 h后進行熒光測定。

1.3 熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（FQ-RT-PCR）檢測RANKLmRNA和OPGmRNA的表達：①引物合成與設計見表1，由上海英俊公司合成。②細胞總RNA的提取與檢測：按照Trizol試劑盒的方法提取總RNA，凝脂糖凝膠電泳觀察RNA質量。③cDNA第一條鏈的合成在PCR管中加入RNA模板5 μL、Primer（50 mol/L） oligio（t）1 μL、dNTP Mix（10 mol/L） 1 μL、再加入DEPC水形成10 μL的Mixture1；65 ℃水浴5 min，然后立即放冰2 min；在10 μL的Mixture 1中加入10×RT butter 2 μL、鎂離子（25 mmol/L）4 μL；0.1 mol/L dTT 2 μL、RNaseout （40 U/μL） 1 μL、SuperScrip Ⅲ RT（200 U/μL） 1μL組成20 μL的體系，進行反轉錄反應。反應條件為50 ℃處理50 min，85 ℃處理5 min立即放置到冰上，在每管反應體系中加入1 μL的RnaseH 37 ℃處理20 min即獲得cDNA。可以放到-20 ℃冰箱中保存。④熒光定量PCR擴增。PCR擴增技術中RNAKL反應過程為：95 ℃預變性2 min→95 ℃變性10 s→60 ℃退火20 s→72 ℃延伸45 s，共40循環；OPG反應過程為：95 ℃預變性2 min→94 ℃變性15 s→60 ℃退火30 s→70 ℃延伸30 s，共40循環，反應后進行曲線分析。

表1 擴增片段所用引物

1.4 統計學方法：采用SPSS13.0軟件進行數據處理，資料采用χ2檢驗，P＜0.05有差異，P＜0.01有顯著差異，P＞0.05無差異。

2 結 果

2.1 48 h后各組RANKL和OPG的比較：經過48 h培養后可以發現，D組培養基中無明顯變化；A組培養基中細胞表達RANKL和OPG均有上升，且RANKL/OPG比值也增加；B組培養基中細胞表達RANKL上升，但OPG下降，RANKL/OPG比值下降；C組培養基中RANKL上升，但對RANKL/OPG無明顯影響。見表2。

表2 四組培養皿中表達RANKL、OPG和RANKL/OPG的比較

將A、B、C三組與D組進行比較，對比表達RANKL時：A組和D組比較t=4.8371，P=0.0008；B組和D組比較t=3.6742，P=0.0010；C組和D組比較t=24.4107，P=0.0000。對比表達OPG時：A組和D組比較t=22.0895，P=0.0000；B組和D組比較t=1.6675，P=0.0032；C組和D組比較t=1.6675，P=0.0153。對比表達RANKL/OPG時：A組和D組比較t=.9954，P=0.0037；B組和D組比較t=29.7945，P=0.0000；C組和D組比較t=1.0547，P=0.3284。

3 討 論

白細胞介素最初是由白細胞產生又在白細胞間發揮作用，所以由此得名，現仍一直沿用。最初是指由白細胞產生又在白細胞間起調節作用的細胞因子。現在是指一類分子結構和生物學功能已基本明確、具有重要調節作用而統一命名的細胞因子，它和血細胞生長因子同屬細胞因子。RHIL-1α屬于白細胞介素-1，其又稱重組人白細胞介素-1α，是一種具有廣泛生物學活性的破骨細胞活化因子，是由活化的單核巨噬細胞產生，具有免疫調節和發生內分泌反應的作用，還可以促進人牙周膜細胞參與骨吸收活動。在以前的研究中發現重組人白細胞介素-1α可以影響成骨細胞的轉錄，本次試驗則可以證明重組人白細胞介素-1α對人牙周膜成纖維細胞表達RANKL和OPG也有顯著效果。它可以將二者同時上調。

1，25-（OH）2D3又名1，25二羥基維生素D3。正常情況下，1，25二羥基維生素D3由它的前體25-羥膽固化醇在腎臟合成。人體每日生理合成的1，25二羥基維生素D3為0.5～1.0 μg。在骨形成活躍時期（例如生長或妊娠期），其合成量也略有增加。1，25二羥基維生素D3能促進腸道對鈣的吸收，并且調節骨質的鈣化。對于嚴重腎功能衰竭，特別是長期接受血液透析治療的患者，內源性骨化三醇的合成明顯減少甚至完全停止。在研究可以發現，在1，25二羥基維生素D3培養基中培養的細胞表達RANKL上升，但OPG下降。說明這種因素有利于破骨細胞的生成，促進了牙槽骨的吸收。

從本次實驗中可以看出，A組培養基中細胞表達RANKL和OPG均有上升，且RANKL/OPG比值也增加（P＜0.05）；B組培養基中細胞表達RANKL上升（P＜0.05），但OPG下降（P＜0.05），RANKL/OPG比值下降（P＜0.05）；C組培養基中RANKL上升（P＜0.05），但對RANKL/OPG無明顯影響（P＞0.05）。因此可以看出，重組人白細胞介素-1α和1，25二羥基維生素D3與人牙周膜成纖維細胞表達RANKL和OPG有密切的關系。

目前，重組人白細胞介素-1α和1，25二羥基維生素D3是一個調節人牙周膜成纖維細胞表達RANKL和OPG的有效預診手段，且此類檢測操作方便、成本低廉［5］。通過試驗可以得知重組人白細胞介素-1α和1，25二羥基維生素D3與人牙周膜成纖維細胞表達RANKL和OPG有密切的關系，但二者聯合使用時對RANKL/OPG既無明顯增加也無沒明顯下降的變化，所以研究具體原因及相關調節機制將是我們下一步研究的重點。

［1］ 張蘭，孫琳琳，丁巖，等.IL-1β對人牙周膜成纖維細胞OPG、RANKLmRNA表達的影響［J］.牙體牙髓牙周病學雜志，2012，22（8）: 440-441.

［2］ 陳良嬌，蘭澤棟，陳建明.rhIL-1α、1，25-（OH）2D3聯合作用對人牙周膜成纖維細胞表達RANKL和OPG的影響［J］.口腔醫學研究，2012，4（28）:316-317.

［3］ 張蘭，孫琳琳，丁巖，等.葡萄糖對人牙周膜成纖維細胞OPG、RANKLmRNA表達的影響［J］.中國美容醫學，2013，1（22）:71-72.

［4］ 陳良嬌，蘭澤棟，陳建明.重組人白介素-1α對人牙周膜成纖維細胞表達RANKL和OPG影響的熒光定量RT-PCR研究［J］.口腔醫學研究，2010，26（2）:197-198.

［5］ 于鑫，王月秋，許海平.Toll樣受體2和4在脂多糖誘導人牙周膜成纖維細胞表達細胞核因子-B受體活化因子配基中的作用［J］.華西口腔醫學雜志，2012，3（30）:325-326.

R78

B

1671-8194（2015）13-0088-02