精子DNA碎片率與形態學及輔助生殖結局的相關性分析研究

瞿 虎江春強汪中揚* 操日亮張 靖陳文秋馬 波

（1中山大學附屬第六醫院泌尿外科，廣東 廣州 510655；2中山大學附屬第六醫院生殖醫學研究中心，廣東 廣州 510610；3廣東省婦幼保健院小兒外科，廣東 廣州 510010）

精子DNA碎片率與形態學及輔助生殖結局的相關性分析研究

瞿 虎1，2江春強1汪中揚1* 操日亮3張 靖2陳文秋2馬 波1

（1中山大學附屬第六醫院泌尿外科，廣東 廣州 510655；2中山大學附屬第六醫院生殖醫學研究中心，廣東 廣州 510610；3廣東省婦幼保健院小兒外科，廣東 廣州 510010）

目的 研究分析不育患者精子形態學、DNA碎片率相互關系及與輔助妊娠結局關系。方法 采用染色質擴散（SCD，彗星實驗）方法檢測計算精子DNA碎片指數（DFI），WHO人類精液檢查與處理實驗室手冊（5版）標準測定精子畸形率，分析探討二者之間及與輔助妊娠結局的關系。結果 畸精組行ICSI治療入組207例，單次妊娠成功率41.55%，同期正常對照組220例成功率47.73%，差異有統計學意義；DFI＞30%與DFI≤30%組成功率分別為39.09%和46.39%，有顯著性差異。結論 男性不育患者中精子DNA碎片（DFI）可作為獨立的精液檢測、生育力及輔助生殖結局評估指標。

精子；DNA碎片；形態學；輔助生殖

傳統的精液分析主要為精子密度、活動力和形態學檢查等，但不能全面評估男性生育力，因發現約有15%的男性不育患者傳統精液檢查相關指標是“正常”的，因此有必要探討新的不育評價指標。隨著男性不育相關研究的深入及發展，在輔助生殖治療（ART）臨床診療工作中逐漸更為注重精子DNA碎片、精漿活性氧、精子形態（畸形率）等檢測指標與男性生育能力及輔助生殖成功率的相互關系。本研究結合目前國內外研究現狀，對精子碎片率以及精子畸形率與人工輔助生殖的結局進行研究，指導實際臨床診療中男性生育能力評估及預測人工輔助生殖治療的結局。

1 材料與方法

1.1 病例選擇：選取我院生殖中心2011年3月至2012年12月就診不育男性患者，均為已婚同居性生活正常未避孕1年以上未育，年齡21～53（24.0±8.0）歲，規律排精后2～7（3～5）d手淫法完整采集精液標本檢測分析，共入組患者1831例。

1.2 精子質量分析：按《WHO人類精液檢查與處理實驗室手冊（第五版）》標準，采用計算機輔助的精子自動分析系統（WL900，北京偉力），包括濃度、前向運動率及運動分級等指標。并行人工檢測雙重校正及雙檢測人員單份標本重復測定校正。

1.3 精子形態分析：精子形態學（畸形率）按照WHO推薦方法，采用巴氏染色法，嚴格（Tygerberg）標準進行分析評估，并詳細區分頭、頸、尾等不同缺陷及計數。

1.4 精子DFI分析精子DNA碎片測定采用彗星實驗-單細胞電泳凝膠實驗（SCGE）。方法，低熔點瓊脂糖包埋，堿裂解（pH＞13），電泳裂解后細胞；對DNA進行染色，鏡檢，根據拖尾情況，對細胞DNA損傷程度進行評估；

1.5 與輔助妊娠結局關系分析：對單純畸精癥患者進入輔助妊娠治療后，在排除女方明顯卵巢功能衰退及卵子質量因素后分AIH、IVF及ICSI三組并與同期精液正常對照組進行輔助妊娠結局對比分析。

1.6 統計學分析：采用SPSS 13.0 軟件包統計分析，分組資料采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法方差分析，雙變量相關分析比較DFI與其他精液檢查指標的相關性，對有相關的變量采用多元逐步回歸分析篩選相關變量。

2 結 果

1831例入組患者中畸形率檢測＞96%（畸精癥）644例（35.17%）、929例DFI檢測中＞30%患者246例（26.48%）、畸形率≤96%而DFI＞30%者18.03%（106/588）、畸形率＜85%患者5.08%（93/1831，DFI均＜30%）、DFI≤30%者583例，其中畸形率＞96%者29.28%（200/683）；精子DFI與精液常規檢查指標相關性分析見表1及表2。AIH治療組成功率對比見表3，IVF治療組成功率對比見表4，ICSI治療組成功率對比見表5。

3 討 論

伴隨男科學的不斷發展，對精子受精能力的判斷標準從最初的注重精子密度到關注精子活力，逐漸到最新的觀點認為精子形態才是決定精子能否受精的關鍵因素［1］。WHO精液檢測分析手冊第五版相對于前四版手冊在畸形率等方面參考范圍已有重大更改，但對其診斷標準及參考值范圍等的爭議國內外廣泛存在。

表1 精子DFI與精液常規檢查指標的相關性

表2 DFI與精液檢查指標的雙變量相關分析結果

表3 AIH治療組成功率對比

表4 IVF治療組成功率對比

表5 ICSI治療組成功率對比

精子DNA檢測方法現已發展成熟完善，近年來對于精子DNA碎片化問題愈發關注，精子DNA碎片化程度已被認為是一個新的評價精子質量和預測生育能力的指標［2］。DNA碎片程度反映精子遺傳物質的完整性，對于成功妊娠和子代健康至關重要，精子DNA發生碎片化對生育將會產生負面影響，造成不育和反復流產。精子發生過程中的染色質包裝過程如發生缺陷會導致精子的DNA碎片化，因是對男方的基因組進行改裝并將遺傳信息完整地傳遞給卵母細胞，使得胚胎發育的早期階段其有正確的基因表達［3-5］。

本研究早期的結果已證實精漿中氧化應激產物如過氧化氫、丙二醛等對有效精子數及密度有相關及影響。氧自由基（ROS）過多和抗氧化酶的平衡失調導致的ROS過多，會造成精子DNA單鏈和雙鏈的斷裂。如精索靜脈曲張患者的精子DNA碎片化指數（DFI）明顯高于正常，而且DFI與ROS水平成明顯正相關，提示精子DNA損傷可能是由于精液中的氧壓脅迫造成的［6-8］。

本研究中1831例畸形率檢測中＞96%（畸精癥）644例（35.17%）、929例DFI檢測中＞30%患者246例（26.48%），畸形率≤96%而DFI＞30%者18.03%（106/588）、畸形率＜85%患者5.08%（93/1831，DFI均＜30%）、DFI≤30%者683例，其中畸形率＞96% 者29.28%（200/683），見表1、2所示，DFI與精液檢測指標多項相關。且精子DNA碎片化指數穩定性高，不隨季節發生變化。

本研究中畸精組行AIH治療126例，單次妊娠成功率13.49%，同期正常對照組患者110例，單次成功率15.45%，DFI＞30%與DFI≤30%組AIH成功率均無統計學差異，對此我們認為尚需更大規模數據及排除更多女方未檢出影響因素；而畸精組行IVF治療入組253例，單次妊娠成功率39.53%，同期正常對照組301例次，成功率43.19%，差異有統計學意義，P＜0.05；DFI＞30%與DFI≤30%組成功率分別為35.83%及47%，差異有顯著統計學意義。畸精組行ICSI治療入組207例，單次妊娠成功率41.55%，同期正常對照組220例成功率47.73%，差異有統計學意義；DFI＞30%與DFI≤30%組成功率分別為39.09%和46.39%，有顯著性差異。

綜上所述，我們認為傳統的精液分析指標如密度、活動力檢查等不能全面評估男性生育力，尤其是評估精子的實際內在質量，精子形態學、精子DNA碎片等已成為新的相互獨立的評測指標，精子形態學的測定受主觀性影響偏倚誤差太大，新的參考范圍在實際工作中的應用有極大的爭議，此前國內尚缺乏此方面大規模、大樣本量的系統性相關研究數據的收集及分析，本研究仍在繼續深入進行中希望解決相關方面的疑惑及問題。

［1］ Grigoriou O，Pantos K，Makrakis E，et al.Impact of isolated teratozoospermia on the outcome of intrauterine insemination［J］. Fertil Steril，2005，83（3）:773-775.

［2］ 孫靜波，姜宏，何瑞冰.精子DNA完整性與精液參數的相關性研究［J］.安徽醫科大學解放軍臨床學院生殖醫學中心，中國男科學雜志，2010，24（4）:26-29.

［3］ Agarwal A，Allamaneni SS.Sperm DNA damage assessment: a test whose time has come［J］.Fertil Steril，2005，84（4）:850-853.

［4］ Agarwal A，Sharma R K，Nallella K P，et al.Reactive oxygen species as an independent marker of male factor infertility［J］. Fertil Steril，2006，86（4）:878- 885.

［5］ De Lamirande E，Gagnon C.Reactive oxygen species and humanspermatozoa.II.Depletion of adenosine triphosphate plays an important role in the inhibition of sperm motility［J］.J Androl，199 2，13（5）:379-386.

［6］ 操日亮，汪中揚，馬波，等.不育男性精漿中過氧化氫測定在評估精液質量中的意義［J］.實用醫學雜志，2012，28（2）:224-226.

［7］ 操日亮，梁曉燕，馬波，等.精漿中丙二醛測定在評估不育男性精液質量中的意義［J］.廣東醫學雜志，2012，6（3）:351-353.

［8］ Smith R，Kaune H，Parodi D，et al.Increased sperm DNA damage in patients with varicocele: relationship with seminal oxidative stress［J］.Hum Reprod，2006，21（4）: 986-993.

Correlation Analysis and Research Between Sperm DNA Fragments and Morphology and Assisted Reproductive Outcomes

QU Hu1，2， JIANG Chun-qiang1， WANG Zhong-yang1*， CAO Ri-liang3， ZHANG Jing2， CHEN Wen-qiu2， MA Bo1
（1 Department of Urology， the Sixth Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510655， China； 2 Reproductive Medicine Research Center of the Sixth Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510610， China； 3 Department of Pediatric Surgery， Guangdong Provincial Maternity and Child Health Hospital， Guangzhou 510010， China）

Objective To analyze and research the relation between DFI in male infertile patients and sperm morphological test and assisted reproductive outcomes. Methods DFI were tested by SCD assay and Sperm morphology was defined by WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen（5th edition）. The relation of DFI and sperm morphological test and assisted reproductive outcomes was analyzed. Results Abnormal sperm group for ICSI treatment group of 207 cases， single pregnancy success rate of 41.55%， the same period in normal control group of 220 patients with success rate of 47.73%， the difference has statistical significance； DFI＞30% and DFI is less than or equal to 30% power were 39.09% and 46.39%， there was significant difference. Conclusion The DFI can be a solitary evaluation index for semen test in male infertile patients

Sperm； DNA fragmentation； Morphology； Assisted reproductive

R71

B

1671-8194（2015）13-0001-03

廣東省醫學科研基金項目，項目編號A2011215

E-mail： zslymnwk@163.com