SRB法檢測沒食子酸乙酯對PC12細胞的毒性作用

黃金蘭等

【摘 要】目的：研究沒食子酸乙酯對PC12細胞的毒性作用。方法：SRB法體外檢測沒食子酸乙酯對PC12細胞的毒性。結果：不同濃度的沒食子酸乙酯對PC12細胞的增值均有不同程度的抑制作用，且呈劑量依賴性。結論：1.25μg/mL～5μg/mL濃度范圍沒食子酸乙酯對PC12細胞的毒害最小。

【關鍵詞】沒食子酸乙酯；PC12；毒性

在阿爾茨海默病（AD）患者腦組織中普遍存在著神經氧化損傷，AD病人腦中表現出異常高的氧化修飾蛋白、脂類和DNA水平，保護神經元免受氧化脅迫并在尋找合適的抗氧化劑，是防治AD的有效手段。沒食子酸乙酯是一種用于油脂的抗氧化劑、食品添加劑及某些藥品的中間體，據報道，沒食子酸乙酯具有對神經細胞的氧化應激損傷具有一定保護作用，但同時在一定濃度范圍內對神經細胞SH-SY5Y也有一定的毒性[1]，本研究擬以沒食子酸乙酯為研究對象，體外評價其對小鼠腎上腺嗜鉻瘤細胞株PC12的毒性作用。

1 材料

1.1 藥物、細胞株與主要試劑

沒食子酸乙酯（購自阿拉丁，E119029）；小鼠腎上腺嗜鉻瘤細胞株PC12（上海細胞生物研究所細胞庫）；Sulforhodamine B（Sigma，批號230162），胚胎牛血清（FBS，Thermo，批號SV30087.02）；DMEM（Life，12800-017）。

1.2 主要儀器

CO2培養箱（Thermo，型號：3111），倒置顯微鏡（Olympus，型號：IX53），酶標儀（Bio Tek，型號：Elx808）

2 方法

2.1 細胞培養

PC12細胞置37℃、5%CO2的培養箱中，用含10% FBS的高糖DMEM培養液培養。倒置顯微鏡觀察細胞生長情況，0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對數生長期細胞用于實驗。

2.2 SRB法檢測沒食子酸乙酯對PC12細胞的毒性

取對數生長期PC12細胞，胰酶消化，調整濃度為10000個/mL的單細胞懸液并接種于96孔培養板，100μL/孔，24h后加入含不同濃度沒食子酸乙酯培養液，對照組加入等體積溶劑培養液，每組設6個復孔（重復3次），置培養箱中培養72h，終止時棄培養液，加入100μL預冷的10%TCA固定，4℃冰箱置1h。棄固定液，清水洗3次，甩干干燥，每孔加入100μL0.4%SRB室溫作用30min，用1%冰醋酸洗去游離染料。甩干干燥，每孔加入100μL10mM Tris溶解，放搖床直至染料全部溶解。最后用酶標儀在564nm波長處測定OD值。細胞抑制率%=（1-實驗組平均OD/對照組平均OD）×100%

2.3 統計學處理

采用SPSS11.5進行統計學處理。計量資料以x±s表示。組間比較采用配對t檢驗。

3 結果

由表1結果顯示，不同濃度的沒食子酸乙酯對PC12細胞的增值均有不同程度的抑制作用，并隨濃度增加，抑制率增大即細胞存活個數越少（圖1），其中1.25μg/mL～5μg/mL濃度范圍對PC12細胞的毒害最小。

4 討論

磺基羅丹明B（sulforhodamine B，SRB）是一種蛋白質結合染料，可與生物大分于中的堿性氨基酸結合，其顏色變化與活細胞蛋白成正比。SRB法不僅具備MTT法操作簡便、敏感的特點，而且測量結果不受時間影響，特別適用于大規模藥物篩選及毒性評價。

PC12細胞是大鼠腎上腺髓質嗜鉻瘤分化細胞株，屬神經嵴源性，具神經內分泌細胞的一般特征，且具可傳代特點，能夠代替原代培養的神經細胞[2]，廣泛應用于神經生理、藥理學研究。

沒食子酸乙酯作為一種抗氧化劑，神經細胞的氧化應激損傷具有一定保護作用，但其有一定細胞毒性，本研究采用SRB法進一步評價其對PC12細胞的毒性作用。結果顯示不同濃度的沒食子酸乙酯對PC12細胞的增值均有不同程度的抑制作用，且呈劑量依賴性，其中1.25μg/mL～5μg/mL濃度范圍對PC12細胞的毒害最小。

【參考文獻】

[1]田偉，畢玉婷，周啟龍，等.沒食子酸酯對神經細胞的抗氧化保護作用研究[J].天然產物研究與開發，2013，25：1423-1427.

[2]黃文超，李云峰，羅質璞.單胺遞質對皮質酮所致的PC12細胞損傷的保護作用[J].中國藥理學通報，2003，19（1）：103-106.

[責任編輯：湯靜]