金銀花葉總黃酮抑菌作用研究

原增艷等

【摘 要】目的：探討金銀花葉總黃酮的體外抑菌作用。方法：采用管碟法及微量稀釋法，測定不同濃度的總黃酮對不同病原微生物的抑菌效果及最小抑菌濃度。結(jié)果：金銀花葉總黃酮提取物對6種菌株均有抑制作用，金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌對金銀花葉總黃酮最敏感，抑菌圈直徑>15mm，MIC≥1；金黃色葡萄球菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株和耐甲氧西林耐藥菌株對金銀花葉總黃酮的敏感度無明顯差異。結(jié)論：金銀花葉總黃酮有一定的抑菌作用。

【關(guān)鍵詞】金銀花葉；總黃酮；抑菌作用；最小抑菌濃度

金銀花（Flos Lonicerae）為忍冬科植物，其干燥花蕾或初開的花，具有清熱解毒、抑菌、抗氧化等功效，是常用中藥材之一[1]。但是金銀花的葉片作為副產(chǎn)品，產(chǎn)量很高，一直作為廢棄物被丟棄，沒有得到充分的利用。古代醫(yī)家以人體自身進(jìn)行多次臨床實(shí)踐，得出了“花葉同效”，明朝李時(shí)珍說“忍冬莖葉及花功用皆同”[2]，具有藥效。在金銀花葉中的總黃酮含量是花中的2.78倍[3]，黃酮類化合物有非常廣泛的抗菌作用[4-6]。金銀花葉中總黃酮抗菌作用如何對金銀花葉的開發(fā)利用至關(guān)重要，因此，本文對金銀花葉中總黃酮進(jìn)行粗提，初步探討金銀花葉片中的總黃酮的體外抑菌作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

金銀花葉：河南封丘，新鄉(xiāng)博凱生物技術(shù)有限公司加工，系5月份第一茬花，將其上葉片取下，晾干，粉碎，過40目篩，備用。

菌株：大腸埃希菌（ATCC25922）、金黃色葡萄球菌（ATCC25923）、銅綠假單胞菌（ATCC27853）、肺炎鏈球菌（ATCC49619）、臨床分離MRSA菌株253、254。以上菌種均由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院臨床微生物學(xué)與免疫學(xué)檢教研室提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總黃酮的提取

稱取金銀花葉粉末30g，按固液比1：10加入75%乙醇，于70℃提取1.5h，抽濾，濾渣再加入300mL75%乙醇，提取1h抽濾，合并兩次提取液，減壓蒸除溶劑；濃縮后提取液加適量水溶解，石油醚脫色，取下層液體；再用乙酸乙酯萃取，每次100mL，萃取至溶劑層無色；合并上層液體，減壓濃縮，濃縮后的提取物即為金銀花葉的總黃酮。

1.2.2 菌懸液的制備

將供試菌株在血平板上活化，以無菌生理鹽水配制菌液，用MHA肉湯調(diào)整菌液濃度至1×105cfu/mL。

1.2.3 抑菌效果的測定

采用管碟法，在無菌條件下，吸取已配制好的菌懸液100μL放入MH培養(yǎng)基上，用無菌棉簽涂抹涂勻，稍干后在每個(gè)平皿內(nèi)等間距的放入3個(gè)無菌鋼管，靜止5min。以無菌生理鹽水為空白對照，每孔加微孔過濾器滅菌的10mg/mL總黃酮100μL，將平皿蓋好，37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)18-24h后，用游標(biāo)卡尺測量清晰抑菌圈直徑（mm），每種提取物平行6次。肺炎鏈球菌需CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。抑菌效果判斷標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[7]：以抑菌圈直徑>20mm為極敏，抑菌圈直徑在15-20mm之間為高敏，抑菌圈直徑在10-14mm之間為中敏，抑菌圈直徑<10mm為低敏，無抑菌圈為耐藥。

1.2.4 最低抑菌濃度（MIC）的測定

采用微量稀釋法，將總黃酮用MH肉湯倍比稀釋成32、16、8、4、2、1、0.5mg/mL6個(gè)梯度濃度，各取100μL依次加入96孔板，每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)。每孔加入濃度為1×105cfu/mL的菌懸液，使各孔藥終濃度從依次為16、8、4、2、1、0.5、0.25mg/mL。以不加菌懸液的總黃酮為陰性對照，37℃培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。所有陰性對照孔培養(yǎng)基澄清，說明本實(shí)驗(yàn)方法可行。孔底部清晰不出現(xiàn)菌體沉淀的最低抗菌藥物濃度，即為該菌的最小抑菌濃度（MIC）。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 金銀花葉總黃酮提取物對不同菌株的抑菌效果比較

結(jié)果見表1，由試驗(yàn)結(jié)果可見，當(dāng)總黃酮濃度在10mg/mL時(shí)，金黃色葡萄球菌菌株ATCC25923及MRSA254、肺炎鏈球菌抑菌圈直徑大于20mm，抑菌效果極度敏感；MRSA253、銅綠假單胞菌抑菌圈直徑在10-20mm，對總黃酮高度敏感；大腸埃希菌的抑菌圈直徑在10-15mm，抑菌效果為中度敏感。金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株與耐藥菌株對總黃酮的敏感度無顯著差異。

2.2 金銀花葉總黃酮提取物對不同菌株的最低抑菌濃度比較

結(jié)果見表2，金銀花葉的總黃酮提取物對6種的菌株有不同程度的抗菌活性，其中對金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌的抑菌效果要強(qiáng)于大腸埃希菌及銅綠假單胞菌的抑菌活性；總黃酮對ATCC25923、MRSA254、ATCC49619的抑菌活性最強(qiáng)，MIC達(dá)到0.5mg/mL，對ATCC25922的抑菌活性最弱。

3 討論

隨著抗生素的濫用，耐藥菌株不斷增加，出現(xiàn)逐年上升的趨勢，中藥抑菌成分較多，可作用于細(xì)菌的不同部位和繁殖的不同階段，使病原微生物不易產(chǎn)生耐藥性，因此，中醫(yī)藥預(yù)防和治療感染性疾病近年來受到越來越多的關(guān)注，從天然植物中提取抗菌成分開發(fā)新型抗菌藥的重要組成部分。研究表明，黃酮具有較好的抑菌效果，很多學(xué)者已經(jīng)從丁香、烏飯樹、白花蛇舌草等植物中提取黃酮，證明其較好的抑菌活性[4-6]。金銀花葉中黃酮含量比常用藥材金銀花中的黃酮含量要高，筆者對金銀花葉中總黃酮進(jìn)行粗提，針對4種常見病原菌做了藥敏試驗(yàn)及MIC的測定，由結(jié)果可見，金銀花葉總黃酮對實(shí)驗(yàn)菌株都有抑制作用，其中對肺炎鏈球菌及金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好。針對目前常見耐藥菌株，本文選用臨床篩選的兩株耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌做抑菌試驗(yàn)，結(jié)果表明，金銀花葉總黃酮對金黃色葡萄球菌耐藥菌株的抑制作用與標(biāo)準(zhǔn)菌株相比無顯著差異，金銀花葉總黃酮的抑菌作用可能不受耐藥菌株變異位點(diǎn)的影響，還有待于進(jìn)一步研究。

【參考文獻(xiàn)】

[1]林段嫦，宋勁詩.金銀花中綠原酸提取工藝探討[J].中成藥，1994，16（7）：16-17.

[2]林國通.中藥學(xué)[M].長沙：湖南科學(xué)技術(shù)出版社，1985，64.

[3]張寧，曹光群.金銀花葉的抑菌活性和抗氧化性研究[J].牙膏工業(yè)，2009，3：29-33.

[4]王宇習(xí).丁香葉總黃酮的提取液工藝及抑菌效果評價(jià)[D].黑龍江：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[5]張海燕，王立，張暉.烏飯樹樹葉水溶性黃酮的抑菌作用的研究[J].中國食品添加劑，2010（5）：62-67.

[6]王宇翔，張艷，方明，等.白花蛇舌草總黃酮的抗炎和抗菌作用[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，2005，21（3）：348-350.

[7]蔣放軍.湘蕾金銀花提取物體外抑菌及抗氧化作用研究[D].湖南：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

[責(zé)任編輯：湯靜]