不同種植物葉中黃酮的提取及比較

陳生錕　等

【摘 要】用超聲波提取法對三種植物葉進行單因素提取實驗，并用索氏提取法和微波提取法作了對比試驗，然后對超聲波提取法進行了正交試驗并確定了最優提取條件。得出不同植物葉中黃酮提取率最高的方法為超聲提取法，其最佳提取工藝分別為銀杏：70%乙醇，時間50 min，料液比1：20，溫度70 ℃。竹葉：70%乙醇，時間40 min，料液比1：22，溫度60 ℃。杜仲：50 %乙醇，時間40 min，料液比1：22，溫度60 ℃。通過該實驗對比得出不同植物中提取黃酮含量最高的方法為超聲波提取法，確定了不同植物中黃酮提取含量的最高的植物為竹葉。

【關鍵詞】黃酮 微波法 超聲提取波 正交試驗

1材料與方法

（1）材料與儀器。樣品：銀杏葉、竹葉采自畢節，杜仲采自織金，均為2013年10月份采摘，洗凈，烘干，粉碎，備用。

試劑：蘆丁標準品、乙醇（無水乙醇）、氫氧化鈉（分析純）、硝酸鋁（分析純）、亞硝酸鈉（分析純）

（2）標準曲線的繪制。取100度下干燥之恒重的蘆丁15.26 mg，用50%乙醇配制濃度0.50 mg/mL的蘆丁標準品，取上述蘆丁標準溶液0 mL、l mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL，分別轉入25 mL容量瓶中，加l mL5%的NaN02，6 min后加入10%1 mLAI（NO3）3，6 min后加入10 mL 4%NaOH充分振蕩搖勻，用蒸餾水定容至刻度，靜置30 min后，以蘆丁含量為0.000 mg/mL的標準溶液為參比，于500 nm處測定吸光度（Abs），得回歸方程：Y=9.3036X+0.0077，相關系數R2=0.9992。

（3）樣品黃酮含量的計算。吸取5ml的提取樣品至于25ml容量瓶中，按上述繪制蘆丁標準曲線的步驟配制提取溶液，測量提取液的吸光度A，按下面的公式計算出植物葉黃酮的含量：

黃酮含量

式中C一由測得的吸光值代入回歸方程計算得到的黃酮濃度，mg/mL

V一溶液的體積，mL ； 為黃酮的百分含量；m為稱取樣品的質量，g

（4）索氏提取法提取不同種植物葉中黃酮類化合物。準確稱取竹葉、銀杏葉、杜仲葉粉末各5.000 g于索氏提取儀中，在70%乙醇，時間2 h，料液比1：20的條件下，用100 mL乙醇進行索氏提取之無色，趁熱旋蒸濃縮，后冷凍12 h，過柱（活性炭和氧化鋁）除去葉綠素，置于50 mL容量瓶用50%乙醇定容[3]。按“1.2”方法測定吸光度，并根據標準方程和黃酮含量的計算公式求出不同植物中黃酮化合物的含量分別為：竹葉0.497%、銀杏0.746% 、杜仲0.629%。（對比試驗）

（5）微波提取法提提取不同種植物葉中黃酮類化合物。準確準確稱取竹葉、銀杏葉、杜仲葉粉末各5.000 g，加入到圓底燒瓶中，在70%乙醇，時間50 min，功率400 W，溫度70 ℃的條件下，用100 mL乙醇進行微波提取，趁熱旋蒸濃縮，后冷凍12 h，過柱（活性炭和氧化鋁）除去葉綠素，置于100 mL容量瓶用50%乙醇定容[4]。按“1.2”方法測定吸光度，并根據標準方程和黃酮含量的計算公式求出不同植物葉中黃化合物的含量分別為：竹葉 0.660%銀杏0.866% 杜仲1.165%。（對比試驗）

（6）超聲波提取法提取不同種植物葉中黃酮類化合物。準確稱取竹葉、銀杏葉、杜仲葉粉末各5.000g，加入到圓底燒瓶中，用不同的乙醇濃度、超聲時間、料液比、超聲溫度分別進行單因素影響實驗。 為全面考察超聲波取法提取不同種植物葉中黃酮類化合物的影響因素[5]，在單因素實驗的基礎上，選取各單因素的最優條件，設計正交實驗L9（34），確定植物葉黃酮的最佳提取條件。

2 結果與分析

2.1 超聲波提取單因素實驗

（1）乙醇濃度對黃酮提取的影響 稱取竹葉、銀杏葉、杜仲葉粉末各5.000 g ，分別用濃度為30%、50%、70%、95%的乙醇溶液在50 ℃ ，料液比（g：mL）1：20 ，超聲波功率50 Hz提取30 min ，趁熱旋蒸濃縮 ， 加石油醚萃取葉綠素，后用50%乙醇稀釋定容至50 mL ，測定其吸光值 ，得黃酮含量與乙醇濃度之間的關系，實驗結果見圖1。

圖1乙醇濃度對黃酮含量的影響

由圖1可知，銀杏葉在乙醇濃度為70%時，總黃酮的含量最高，之后趨于平緩，因此乙醇濃度為70%為最佳。竹葉在70%時，總黃酮含量最高，之后下降，所以70%為竹葉最佳的乙醇提取濃度。杜仲葉在30%～50%時黃酮含量呈上升趨勢，50%～95%趨于下降，所以50%為最佳提取濃度。

（2）提取時間對黃酮提取的影響 稱取竹葉、銀杏葉、杜仲葉粉末各5.000 g ，分別以30 min、40 min、50 min、60 min的不同提取時間在50 ℃ ，料液比（g：mL ）1：20 ，50 Hz超聲波提取。趁熱旋蒸濃縮 ， 加石油醚萃取葉綠素，后用50%乙醇稀釋定容至50 mL ，測定其吸光值 ，得黃酮含量與提取時間之間的關系，實驗結果見圖2。

圖2提取時間對黃酮含量的影響

由圖2可以看出，銀杏葉在40 min時黃酮提取含量值較高，故最佳提取時間為40 min為宜。竹葉在40 min黃酮提取含量值達到最高，往后趨于下降，所以最佳提取時間為40 min最佳。杜仲葉在30 min～50 min黃酮提取含量值上升明顯，60 min明顯下降，故50 min為最佳。

（3）不同料液比對黃酮提取的影響 稱取竹葉、銀杏、杜仲葉粉末各5.000 g ，分別以1：16、1：18、1：20、1：22的不同料液比（g：mL ）在50 ℃ ，50 Hz超聲波提取30 min。趁熱旋蒸濃縮 ， 加石油醚萃取葉綠素，后用50%乙醇稀釋定容至50 mL ，測定其吸光值 ，得黃酮含量與料液比之間的關系，實驗結果見圖3。

圖3不同料液比對黃酮含量的影響

由圖3可以看出銀杏、竹葉、杜仲在1：18處黃酮含量值達到最大，往后或趨于平衡或下降，即在1：18為最佳提取料液比。

（4）不同溫度比對黃酮提取的影響 稱取竹葉、銀杏、杜仲粉末各5.000 g ，分別在40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃下 ，以料液比為1：20（g：mL ），50 Hz 超聲波超聲提取30 min。趁熱旋蒸濃縮 ， 加石油醚萃取葉綠素，后用50%乙醇稀釋定容至50 mL ，測定其吸光值 ，得黃酮含量與溫度之間的關系，實驗結果見圖4。

圖4不同溫度比對黃酮含量的影響

由圖4可以看出，銀杏葉提取黃酮含量的值隨著溫度升高而增大，到60 ℃后趨于平緩，故60 ℃為最佳提取溫度。竹葉在50 ℃黃酮提取含量最高，往后隨溫度升高而下降，所以50 ℃為銀杏最佳提取溫度。杜仲黃酮提取含量隨溫度升高而增大，在60 ℃后增大不明顯，杜仲的最佳提取溫度為60 ℃～70 ℃。

2.2 正交試驗設計

表1 銀杏正交實驗設計L9（34）及結果

編號No 因素

A 乙醇濃度（%） B 時間（min） C 料液比（g/mL） D 溫度（℃） 黃酮含量 （%）

1 50（1） 30（1） 1：18（1） 50（1） 1.013

2 50（1） 40（2） 1：20（2） 60（2） 1.331

3 50（1） 50（3） 1：22（3） 70（3） 1.327

4 70（2） 30（1） 1：20（2） 70（3） 1.356

5 70（2） 40（2） 1：22（3） 50（1） 1.412

6 70（2） 50（3） 1：18（1） 60（2） 1.480

7 95（3） 30（1） 1：22（3） 60（2） 1.442

8 95（3） 40（2） 1：18（1） 70（3） 1.381

9 95（3） 50（3） 1：20（2） 50（1） 1.397

K1 1.224 1.270 1.291 1.274

K2 1.416 1.375 1.398 1.355

K3 1.300 1.401 1.394 1.418

極差（R） 0.192 0.131 0.107 0.144

優化方案 A2B3C2D3

因素排序 A D B C

注： 括號內數值為各因素的水平。

從極差分析結果可以得到，影響銀杏葉黃酮提取含量的主次因素為：乙醇濃度>溫度>超聲時間>料液比，最佳提取工藝為A2B3C2D3，即70%乙醇，時間50 min，料液比1：20，溫度70 ℃

表2 竹葉正交實驗設計L9（34）及結果

編號No 因素

A 乙醇濃度（%） B 時間（min） C 料液比（g/mL） D 溫度（℃） 黃酮含量 （%）

1 50（1） 30（1） 1：18（1） 40（1） 1.375

2 50（1） 40（2） 1：20（2） 50（2） 1.542

3 50（1） 50（3） 1：22（3） 60（3） 1.462

4 70（2） 30（1） 1：20（2） 60（3） 1.625

5 70（2） 40（2） 1：22（3） 40（1） 1.605

6 70（2） 50（3） 1：18（1） 50（2） 1.663

7 95（3） 30（1） 1：22（3） 50（2） 1.482

8 95（3） 40（2） 1：18（1） 60（3） 1.473

9 95（3） 50（3） 1：20（2） 40（1） 1.334

K1 1.456 1.494 1.504 1.438

K2 1.631 1.540 1.500 1.520

K3 1.430 1.486 1.516 1.562

極差（R） 0.201 0.054 0.016 0.124

優化方案 A2B2C3D3

因素排序 A D B C

注： 括號內數值為各因素的水平。

從極差分析結果可以得到，影響竹葉黃酮提取含量的主次因素為：乙醇濃度>溫度>超聲時間>料液比，最佳提取工藝為A2B2C3D3，即70%乙醇，時間40 min，料液比1：22，溫度60 ℃。

表3 杜仲正交實驗設計L9（34）及結果

編號No 因素

A 乙醇濃度（%） B 時間（min） C 料液比（g/mL） D 溫度（℃） 黃酮含量 （%）

1 30（1） 40（1） 1：18（1） 50（1） 0.844

2 30（1） 50（2） 1：20（2） 60（2） 0.732

3 30（1） 60（3） 1：22（3） 70（3） 0.961

4 50（2） 40（1） 1：20（2） 70（3） 1.373

5 50（2） 50（2） 1：22（3） 50（1） 1.347

6 50（2） 60（3） 1：18（1） 60（2） 1.289

7 70（3） 40（1） 1：22（3） 60（2） 1.147

8 70（3） 50（2） 1：18（1） 70（3） 1.262

9 70（3） 60（3） 1：20（2） 50（1） 0.912

K1 0.845 1.121 1.132 1.034

K2 1.336 1.114 1.006 1.199

K3 1.107 1.054 1.152 1.056

極差（R） 0.491 0.067 0.146 0.165

優化方案 A2B1C3D2

因素排序 A D C B

注： 括號內數值為各因素的水平。

從極差分析結果可以得到，影響杜仲葉黃酮提取含量的主次因素為：乙醇濃度>溫度>超聲時間>料液比，最佳提取工藝為A2B1C3D2，即50%乙醇，時間40 min，料液比1：22，溫度60 ℃。

2.3 重復性實驗

為了驗證優化提取條件的可靠性，對銀杏葉、竹葉、杜仲葉分別選其上述最優工藝下重復提取3次，其總黃酮的平均提取含量（%）分別為1.532、1.847、1.462 ，與前面的微波提取法、索氏提取法比較，優于兩者的提取效果。

2.4 提取方法比較

按照研究后的超聲優化提取工藝與傳統的索氏提取法跟新型的微波提取方法作比較，結果見下表4。

表4 不同提取方法對不同植物提取效果比較

項目 黃酮含量（%）

銀杏 竹葉 杜仲

超聲波提取法 1.532 1.847 1.462

微波提取法 0.866 0.660 1.165

索氏提取法 0.746 0.497 0.629

由表可以看出，按照該研究的優化工藝進行提取較傳統的提取方法提取黃酮的含量高，不同植物用不同方法所提取的黃酮含量不同，而不同方法的不同條件對黃酮提取也有很大影響。此外，新型的提取方法比傳統的提取方法還具有簡便、省時、產率高等優點。

3 結語

通過對三種植物葉黃酮提取方法的研究，超聲波提取法與索氏提取法和微波提取方法相對比，得出三中植物葉中提取黃酮含量最高的方法為超聲波提取法，其最佳提取工藝分別為，銀杏：70%乙醇，時間50 min，料液比1：20，溫度70 ℃。竹葉：70%乙醇，時間40 min，料液比1：22，溫度60 ℃。杜仲：50%乙醇，時間40 min，料液比1：22，溫度60 ℃。確定了不同植物中黃酮提取含量的最高的植物為竹葉。

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