朗伯—比爾定律在血紅蛋白濃度檢測中的應用研究

陳婷 孟建昇 謝華相

摘 要：該文從朗伯-比爾定律的基本原理入手，分析了定律在血液細胞分析儀血紅蛋白濃度檢測中的具體應用，為HGB測量單元的設計提供理論依據和參考。

關鍵詞：朗伯—比爾定律 比色 血紅蛋白

中圖分類號：TM741.1 文獻標識碼：A 文章編號：1674-098X（2015）08（c）-0032-02

朗伯—比爾定律是比色分析的基本原理，描述了有色溶液對單色光的吸收程度與溶液濃度和光通過的溶液厚度之間的定量關系。朗伯—比爾定律在許多醫療儀器中都有應用，如血液細胞分析儀、生化分析儀、監護儀等，它的應用包含了機械、光學、化學、電子學等諸多學科方方面面的內容。

1 朗伯—比爾定律

當一束平行單色光通過含有吸光物質的稀溶液時，溶液的吸光度與吸光物質濃度和液層厚度的乘積成正比，即：

A

式中，為吸光系數，它與吸光物質、入射光波長、溶液溫度等因素有關；C為吸光物質的濃度；L為透光液層厚度；透射光強度I與入射光強度I之比稱為透光度或透光率。

朗伯—比爾定律又稱光的吸收定律，它是比色法分析溶液濃度及吸光物質含量的理論基礎。

2 血紅蛋白的檢測方法

在血液細胞分析儀中，血紅蛋白濃度的檢測原理基本都是相同的。被稀釋的血液加入溶血劑后，紅細胞溶解，釋放出血紅蛋白，后者與溶血劑結合形成血紅蛋白衍生物，進入血紅蛋白濃度測定系統。在特定波長（一般在530～550 nm）照射下，吸光度的變化與液體中HGB（Hemoglobin血紅蛋白）含量成比例。血紅蛋白濃度可以通過朗伯—比爾定律，利用比色法進行測定。

采用比色法進行測定時，稀釋液必須能使血中所有的血紅蛋白都轉變為一種穩定的血紅蛋白衍生物。氰化高鐵血紅蛋白法能使除正常人體中很少含有的硫化血紅蛋白外所有的血紅蛋白都轉化成穩定的氰化高鐵血紅蛋白，所測結果穩定，重復性好。因此，氰化高鐵血紅蛋白法已經成為ICSH（International Council for Standardization in Haematology）規定的測定血紅蛋白濃度的標準方法。圖1為ICSH推薦的氰化高鐵血紅蛋白溶液的吸收曲線圖。HICN（hemiglobincyanide）最大吸收峰在540 nm。血液細胞分析儀HGB檢測的校正必須以HICN值為標準。

不同系列血液分析儀配套溶血劑配方不同，形成的血紅蛋白衍生物亦不同，吸光度各異，但最大吸收峰均接近540 nm。為了減少溶血劑的毒性，避免含氰化的血紅蛋白衍生物檢測后的污物處理，近年來，一些血液分析儀溶血劑使用無氰試劑。實驗證明，其形成的衍生物與HICN吸收光譜相似，實驗結果的精確性、準確性達到含有氰化物溶血劑的同樣水平，既保證了實驗質量又避免了試劑對分析人員的毒性和環境污染。

3 血液細胞分析儀的HGB測量組件

在血液細胞分析儀中，采用比色法對HGB進行測定。因此，HGB測量組件也就必須具備類似于分光光度計的各組件。

如圖2所示，HGB測量組件大致可分為單色光源、比色皿、光電傳感器和信號檢測處理單元4部分。其中，前3個部分在機械加工、裝配結構上要求具有良好的同軸度，保證光源發出的光線能夠盡可能的垂直平行入射到比色皿的測量面上，且透射后的光線也應盡可能的垂直平行入射到接收端光電傳感器的接收面上。保證朗伯—比爾定律應用對入射光特性的要求和檢測靈敏度。

4 信號檢測

光電傳感器轉換輸出為一微弱電流信號。某光電二極管照度-電流轉換圖如圖3所示。最大入射光強下光電二極管輸出電流不足1 mA。信號檢測的第一步就是把這個微弱的電流信號通過I/V變換轉換成電壓信號。

由于血紅蛋白衍生物吸光特性穩定，故在進行HGB溶液透射光強測定時，該測定值可視為直流信號。因此，在I/V變換后可根據電路系統對A/D轉換模擬信號輸入范圍增加一級直流放大電路，滿足電路設計需求。

5 HGB測定

由于血液細胞分析儀的結構與分光光度計有較大差異，光源照射到比色皿表面的入射光強難以直接獲得。因此，實際檢測過程中通常以入射光透過稀釋液的透射光強來代替入射光強。在這里稀釋液就是檢測過程中的參比溶液。

（1）參比溶液。

測定試樣溶液的吸光度，需先用參比溶液調節透光度（吸光度為0）為100%，以消除其它成分及比色皿和溶劑等對光的反射和吸收帶來的測定誤差。由于血液細胞分析儀所用的稀釋液和溶血劑均為無色透明，因此，參比溶液選擇稀釋液，以消除比色皿和溶劑對光的反射、吸收帶來的誤差。

設入射光強為I，通過參比溶液后的透射光強為I，吸光度為A，通過樣本溶液的透射光強為I，吸光度為A，參比溶液下吸光度為A。

則：

；比色皿介質吸收及溶劑、器皿反射造成的消光。

A；

吸光度

令，參比溶液下的吸光度A，消除由于比色皿和試劑造成的消光影響。

有：AA。

（2）單組分測量方法。

單組分是指樣品溶液中含有一種組分，或者是在混合物溶液中待測組分的吸收峰與其他共有物質的吸收峰無重疊。在特定試劑作用下，我們可以認為HGB檢測是一種單組分測定。其定量方法包括標準曲線法、標準對比法和吸收系數法。

設溶液厚度為L，吸光物質濃度為C，介質吸收系數為k，入射光波長為，入射光強為，通過參比溶液后的透射光強為，通過樣本溶液的透射光強為，參比溶液下吸光度為A。

由朗伯—比爾定律有

A為樣品在特定波長下的吸光度

k為摩爾吸收系數，單位：升/厘米·摩爾；

L為樣品池厚度，單位：厘米或毫米；

C為樣品濃度，單位：摩爾/升。

對特定溶液而言，上式中只有溶液濃度C是未知量，因此，根據測得的光強值即可算出相應溶液的濃度。

（3）校準曲線法。

配制一系列不同含量的標準溶液，選用適宜的參比，在相同的條件下，測定系列標準溶液的吸光度，作A-C曲線，即標準曲線，也可用最小二乘數處理，得線性回歸方程。

在相同條件下測定未知試樣的吸光度，從標準曲線上就可以找到與之對應的未知試樣的濃度。

（4）標準對比法。

即將待測溶液與某一標樣溶液，在相同的條件下，測定各自的吸光度，建立朗伯-比爾定律，解方程求出未知樣濃度與含量。

在HGB檢測系統中，由于光源、比色皿、光電傳感器等都不是理想器件，且由于制造、裝配等因素，使HGB檢測系統不可避免的存在個體差異。因此，在進行測定時，必須進行系統校正。這里面主要是指對樣本溶液消光系數的校正。通常，通過標定等手段較易解決。

6 結語

該文從朗伯-比爾定律的基本原理入手，分析了定律在血液細胞分析儀血紅蛋白濃度檢測中的具體應用，為HGB測量單元的設計提供理論依據和參考。

朗伯—比爾定律在生化分析儀和監護儀中的應用與其在HGB檢測中的應用大同小異，但由于具體應用場合的不同又各有特色。比如監護儀中采用雙波長光源來檢測血氧飽和度；而生化分析儀在檢測時機上根據試劑反應特性采取終點法、固定時間法、動力學法等手段進行檢測。定律在不同場合下的應用必然帶來不同的設計需求，這些都有待我們去研究總結。

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