司來吉蘭對帕金森病模型大鼠結腸α－Syn Bcl－2表達的影響

畢樹立 高海英

1）河北唐山市開平醫院急診科 唐山 063021 2）河北唐山市豐南區醫院 唐山 063300

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是中、老年人臨床常見的神經系統退行性變性疾病。除典型的運動癥狀表現外［1］，常伴自主神經功能紊亂，腸神經功能紊亂等非運動系統癥狀，且發生率較高［2］，便秘等結腸功能紊亂是臨床中常見的下消化道功能紊亂［3－5］。本研究以魚藤酮制作的帕金森病大鼠模型為對象，觀察司來吉蘭對帕金森病大鼠模型結腸中α－Syn及Bcl－2表達的影響，探討司來吉蘭在帕金森患者消化道功能紊亂中的作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 鹽酸司來吉蘭（Orion CorPoration，芬蘭）；魚藤酮（北京博奧森生物工程有限公司，北京）；葵花油（唐山沃爾瑪超市，唐山）；兔抗大鼠Bcl－2抗體和兔抗大鼠α－Syn抗體（Cell Signaling Technology，美 國）；SP 免 疫 組 化試劑盒、DAB顯色液購自（中杉生物有限公司，北京）；奧林巴斯BX63全自動顯微鏡掃描系統（OLYMPUS，日本）。

1.2 實驗動物 體質量180～250g的健康雄性SD 大鼠60只，按照隨機原則將實驗動物隨機分為正常對照組（對照組）、帕金森病模型組（PD 組）和司來吉蘭治療組（治療組），各組再隨機分為模型制作成功后4d和8d2個時間點，每組每個時間點各10只。

1.3 試驗方法

1.3.1 帕金森病模型的制備：采用頸背部皮下注射魚藤酮制備帕金森病模型［6］。具體操作方法：魚藤酮應用葵花油溶解配制成2mg／mL 魚藤酮葵花油乳液，充分震蕩混勻后避光保存。PD 組和治療組大鼠稱質量后以魚藤酮2mg／kg計算魚藤酮葵花油乳液用量。常規碘伏消毒后，捏起大鼠頸背部皮膚，用1mL注射器皮下注射魚藤酮葵花油乳液。以出現行為學改變作為判定模型成功的指標［7］，選擇2～6分作為實驗大鼠。模型制備成功后，治療組：司來吉蘭0.5 mg／kg每日灌胃，4d及8d2個時間點分別連續灌胃4d和8d。對照組及PD 組每只每日均連續灌胃等體積生理鹽水，直至試驗時間點。

1.3.2 標本制備及檢測：腹腔注射10%水合氯醛溶液4 mL／kg麻醉實驗大鼠。滿意后用4%多聚甲醛灌流組織固定，剖腹后取大鼠結腸，清洗干凈后去除多余組織，取約3cm腸標本多聚甲醛固定24h 過夜行免疫組化檢測，另取約3 cm 腸標本投入液氮，于－80 ℃保存以備行Western blotting。免疫組化檢測：將結腸標本制作成石蠟切片，采用免疫組化SP 法，切片常規脫蠟脫水，3%H2O2溶液室溫作用封閉內源性酶，微波進行抗原修復，滴加血清封閉，滴加適當稀釋的兔抗大鼠一抗（Bcl－2、α－Syn均為1∶200），濕盒孵育，4℃過夜，滴加HRP標記山羊抗兔二抗，37 ℃恒溫箱孵育30 min，蒸餾水洗滌后DAB顯色，蘇木素復染，常規脫水、透明、中性樹脂封片，顯微鏡觀察。采用Image Pro－Plus 6.0圖像分析軟件分析。每張切片在高倍鏡下觀察，陽性產物為棕黃色，以積分光密度（intensive optical density，IOD）為指標進行圖像分析，計算5個高倍顯微鏡下平均光密度值。Western blotting蛋白印記：取各組制備好的大鼠結腸組織20μg，10%SDS－PAGE 電泳分離后，以濕轉法電轉移至PVDF 膜上。轉移后的PVDF膜于封閉液中封閉，然后分別加入兔抗大鼠Bcl－2一抗（1∶1000）、兔抗大鼠α－Syn一抗（1∶1000）孵育過夜。PBS 洗膜，加人相應濃度的二抗（羊抗兔，1∶2000），室溫反應1h，洗膜后ECL 顯色，膠片曝光顯影后，使用Image J軟件進行測定平均灰度值。

1.4 統計學方法 采用SPSS 19.0 統計軟件進行統計分析，計量資料以ˉx±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計意義。

2 結果

2.1 各組α－Syn及Bcl－2免疫組化檢測結果 3組試驗大鼠結腸中均可見α－Syn與Bcl－2陽性表達細胞。PD 組與對照組比較，發現α－Syn表達在2個不同試驗點上均明顯增高（P＜0.05）；Bcl－2在2個不同試驗點上均明顯減低（P＜0.05）。PD 大鼠通過司來吉蘭治療后，治療組與對照組比較，發現Bcl－2表達在2個試驗時間點上明顯減低（P＜0.05），α－Syn表達在2個不同試驗點上均明顯增強（P＜0.05）。治療組與PD 組比較，發現Bcl－2 表達在2 個試驗時間點上明顯增強（P＜0.05），α－Syn表達在2個不同試驗點上均明顯減低（P＜0.05）。各組在不同時間點，發現治療組8d時較4d時α－Syn表達顯著減低（P＜0.05），Bcl－2 表達顯著增強（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠結腸組織中α－Syn及Bcl－2平均光密度比較

表1 各組大鼠結腸組織中α－Syn及Bcl－2平均光密度比較

注：與對照組比較，aP＜0.05；與對照組比較，b P＜0.05；與PD 組比較，c P＜0.05；8d與4d比較，＊P＜0.05

組別 4d α－Syn 8d 4d Bcl－2 8d對照組 130.23±4.65 129.56±5.58 140.65±5.62 142.45±5.54 PD組 168.45±5.52a 170.28±6.24a 102.24±5.23a 99.04±4.82a治療組 156.32±4.42bc 148.54±4.57bc＊115.54±5.43bc 124.54±6.95bc＊

2.2 Western blotting蛋白印記檢測結果 結果顯示PD 組與對照組不同時間點比較，α－Syn蛋白表達較對照組明顯增加（P＜0.05），Bcl－2蛋白表達較對照組明顯減低（P＜0.05）。司來吉蘭治療后，治療組與PD 組不同時間點比較，α－Syn蛋白表達較對照組明顯降低（P＜0.05），Bcl－2蛋白表達較對照組明顯增加（P＜0.05）；但與對照組比較，α－Syn蛋白表達較對照組明顯增強（P＜0.05），Bcl－2蛋白表達較對照組明顯減低（P＜0.05）。各組在不同試驗時間點，發現治療組8d時較4d時，α－Syn蛋白表達顯著減低（P＜0.05），Bcl－2表達顯著增強（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠結腸組織中α－Syn及Bcl－2 Western blotting表達比較

表2 各組大鼠結腸組織中α－Syn及Bcl－2 Western blotting表達比較

注：與對照組比較，aP＜0.05，b P＜0.05；與PD 組比較，c P＜0.05；8d與4d比較，＊P＜0.05

組別 4d α－Syn 8d 4d Bcl－2 8d對照組0.20±0.08 0.21±0.06 15.23±0.20 15.45±0.16 PD組 0.66±0.08a 0.68±0.09a 6.42±0.32a 6.34±0.28a治療組 0.55±0.09bc 0.47±0.06bc＊ 8.28±0.26bc 10.19±0.34 bc＊

3 討論

突觸核蛋白（synuclein，syn）存在于突觸前末梢和神經元核內的蛋白質，有α、β和γ等類型，其中α－突觸核蛋白（αsyn）最初于1988年分離而得［8］，研究表明其存在于多種神經退行性疾病的突觸末梢以及細胞漿的包涵體中［9－10］。

帕金森病是多巴胺能神經元變性、缺失，從而出現典型嗜酸性包涵體－路易小體。在患者的病變路易小體中，研究發現大量的a－syn寡聚體存在，導致多巴胺在細胞體內累積過多而釋放減少，并能產生氧化應激反應加速細胞死亡，在帕金森病的腸神經系統中，肌間神經叢及黏膜下神經叢神經元也存在相同的改變［11］，從而引起腸道功能紊亂，研究［12］發現使用6－OHDA 制作PD 大鼠模型，在大鼠胃竇以及結腸肌間神經叢中α－Syn的表達顯著增強，表明PD 患者出現胃腸道功能紊亂可能與α－syn增多而引起腸神經系統損害造成的。本實驗通過魚藤酮制作PD 模型，發現在PD 組中α－Syn表達顯著強于對照組（P＜0.05）；但經司來吉蘭治療后，治療組 的α－Syn 表 達 顯 著 低 于PD 組，但 仍 高 于 對 照 組（P＜0.05）；且治療8d后，α－Syn的表達顯著低于治療4d時（P＜0.05），表明司來吉蘭能有效抑制PD 結腸中α－Syn 過度表達，從而減少α－Syn在細胞體內的聚集，并減弱氧化應激反應而延緩細胞死亡的進程，進而緩解胃腸道功能紊亂。

B淋巴細胞瘤－2基因（B－cell lymPhoma－2，Bcl－2）為存在于線粒體、內質網以及連續的核周膜的細胞存活促進因子，能夠阻止細胞色素c從線粒體釋放到細胞質，從而抑制了細胞凋亡。引起胃腸道機械活動的起搏細胞為Cajal間質細胞，此細胞的凋亡可能與結腸動力障礙相關。Bcl－2的低表達，抑制細胞凋亡的作用可能減弱，從而導致細胞凋亡加快，從而引發諸如便秘等的結腸動力障礙。本研究發現，在PD模型中，Bcl－2的表達較對照組明顯降低（P＜0.05）；經司來吉蘭治療后，治療組的Bcl－2表達較PD 組明顯增強，但較對照組仍為低表達（P＜0.05）；且經8d的治療后，較治療4d時，Bcl－2的表達顯著增強（P＜0.05）。表明司來吉蘭治療能使Bcl－2的表達增強，從而抑制細胞凋亡，緩解由細胞凋亡引起的結腸功能障礙。

綜上可知，PD 引起的腸道能紊亂，可能與α－Syn的高表達以及Bcl－2的低表達有關，司來吉蘭治療PD 能有效緩解腸道功能紊亂，可能與減輕氧化應激反應以及延緩細胞的凋亡有關。但PD 是多種致病因素引起的導致神經元退行性變，從而導致中樞神經系統、自主神經系統以及腸神經系統的改變而引發多系統出現障礙，具體機制有待進一步研究。

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