雞傳染性法氏囊病與大腸桿菌病混合感染的診斷

王　亮（鶴壁市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南鶴壁　458030）

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雞傳染性法氏囊病與大腸桿菌病混合感染的診斷

王亮
（鶴壁市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南鶴壁458030）

傳染性法氏囊病（IBD）是由傳染性法氏囊病毒（IBDV）引起雛雞的一種急性高度接觸性傳染病，不僅造成感染雛雞的大批死亡，而且更重要的是IBDV可以造成免疫器官法氏囊破壞，導(dǎo)致免疫抑制，從而降低機(jī)體對(duì)其他疾病的抵御能力，從而極易繼發(fā)大腸桿菌病和雞新城疫等，所造成的損失往往超過(guò)該病本身造成的損失。隨著養(yǎng)雞規(guī)模的擴(kuò)大和飼養(yǎng)密度的不斷增加，雞傳染性法氏囊病也在一些地區(qū)雞場(chǎng)中不斷發(fā)生和流行，而且發(fā)病率和死亡率居高不下，給養(yǎng)雞業(yè)帶來(lái)重大經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)發(fā)展。

大腸桿菌廣泛存在于養(yǎng)雞場(chǎng)。免疫抑制病原體感染、呼吸道損傷、饑餓或過(guò)飽、飼料配比不當(dāng)或突然改變、畜禽群密度大、通風(fēng)換氣不良和氣候劇變等均可誘發(fā)雞大腸桿菌病，特別是免疫抑制病原體如IBDV等的感染。該病一年四季均可發(fā)生，對(duì)幼齡畜禽危害更大，可造成病雞氣囊炎、心包炎、肝周炎及輸卵管炎和卵黃性腹膜炎等，隨著大型集約化養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，大腸桿菌對(duì)養(yǎng)雞業(yè)造成的危害已日益明顯。

根據(jù)流行病學(xué)、臨床癥狀和尸體剖檢變化，以及實(shí)驗(yàn)室診斷，此次疫情是由雞傳染性法氏囊病毒和大腸桿菌混合感染引起的，為及時(shí)治療提供了前體。

1　臨床診斷

1.1發(fā)病情況

最初雞舍出現(xiàn)零星發(fā)病的雞，病雞精神沉郁，采食量減少，拉白色水樣糞便。3d后，發(fā)病264只，死亡80只，發(fā)病率18.3%，病死率30.3%。

1.2臨床癥狀

最初發(fā)現(xiàn)雞群采食量減少，拉水樣糞便，有些雞啄自己的泄殖腔，病雞越來(lái)越多，病雞采食廢絕，精神萎頓，羽毛蓬亂，呆立墻角。隨即出現(xiàn)腹瀉，排白色或黃色水樣稀糞，肛門(mén)周圍羽毛粘有糞污。嚴(yán)重病雞頭垂地，閉眼呈昏睡狀態(tài)。嚴(yán)重脫水，極度虛弱，最后死亡。

1.3剖檢變化

病死雞腹腔有纖維素滲出物，呈灰白色，心包膜和肝被膜上附有纖維素性內(nèi)膜，心包膜增厚，心包液增量，混濁；在肝表面和心外膜上有一層黃白色纖維素膜；腎臟腫大，有尿酸鹽沉積而呈紅白相間的“花斑”狀外觀；胸肌和腿肌有條狀出血；法氏囊水腫和出血，體積增大，重量增加，切開(kāi)后黏膜皺褶多混濁不清，囊內(nèi)有少量干酪樣滲出物或白色黏稠液體。

1.4臨床診斷結(jié)果

根據(jù)流行病學(xué)、臨床癥狀和尸體剖檢變化，特別是胸肌和腿肌出血、法氏囊的剖檢變化、拉白色或黃色水樣稀糞以及心包膜和肝被膜上附有纖維素性內(nèi)膜，初步診斷為雞傳染性法氏囊病毒與大腸桿菌混合感染。

2　實(shí)驗(yàn)室診斷

2.1傳染性法氏囊病病毒的RT-PCR診斷

2.1.1RNA提取

取綠豆大小的病死雞法氏囊組織放入滅菌研磨器，研碎，加300μl冰冷DEPC水再磨片刻，凍融3次，4℃5000 g/min離心10min，取200μl上清加入600μlRNAisoPlus，混勻后室溫作用5min，加入200μl氯仿，搖勻作用1～3 min，4℃12000g離心10min。吸取上清，置于另一DEPC水處理過(guò)的eppendorf管中，按上清與異丙醇（1∶1）體積比加入異丙醇，室溫作用10min，4℃12000g離心10min，吸棄上清，DEPC水配制的75%乙醇洗滌2次，干燥后25μl DEPC水溶解沉淀，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2cDNA合成

取RNA懸液3μl與VP2保守位點(diǎn)上、下游引物（上游引物：ACT-GTGGGGGACACAGGGT，下游引物：CTGTCAGTTCACTCAGGCTTCC）各1μl（20pmol）混勻后置于70℃水浴中5min，冰浴10min，再依次加入5?反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液4μl，0.1MDTT2μl，2.5MdNTPs4μl，RNA酶抑制劑1μl（20U），M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶1μl，DEPC水補(bǔ)足20μl，37℃水浴中作用1.5h。95℃作用5min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。

2.1.3PCR擴(kuò)增

10 5BR%聚合酶緩沖液2μl、cDNA2μl，2.5mmol dNTPs1μl，10pmol上、下游引物各0.2μl，5BR%/聚合酶0.2μl后，滅菌去離子水補(bǔ)足20μl，反應(yīng)條件是95℃3 min，94℃50s，56℃45s，72℃40s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7min。取5μlPCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳，檢查擴(kuò)增結(jié)果。

2.1.4RT-PCR結(jié)果

由電泳結(jié)果可知，待檢法氏囊樣品擴(kuò)增出了約270bp的目的片段，與預(yù)期大小相符（如下圖）。

2.2大腸桿菌檢測(cè)

2.2.1涂片鏡檢

無(wú)菌采集病、死雞的肝臟、心血等組織，革蘭氏染色后鏡檢，可見(jiàn)針尖大小兩端鈍圓、多數(shù)散在排列的革蘭氏陰性球桿菌。

2.2.2細(xì)菌分離培養(yǎng)

無(wú)菌采集病、死雞的肝臟，接種麥康凱瓊脂平板，37℃溫箱培養(yǎng)24h，形成圓形、表面光滑、濕潤(rùn)的粉紅色菌落。挑取粉紅色菌落，涂片，革蘭氏染色，可見(jiàn)均勻針尖大小革蘭氏陰性球桿菌。

2.3綜合診斷

根據(jù)流行病學(xué)、臨床癥狀、病理剖檢變化，及RT-PCR和細(xì)菌分離、革蘭氏染色鏡檢結(jié)果，確診為雞傳染性法氏囊病毒與大腸桿菌混合感染。

3　討論

雞傳染性法氏囊病（IBD）是危害我國(guó)養(yǎng)雞業(yè)發(fā)展最嚴(yán)重的疫病之一。準(zhǔn)確快速的診斷對(duì)該病的控制具有積極意義，然而由于IBDV雙股RNA病毒，變異較快，給RT－PCR的應(yīng)用帶來(lái)不便，研究選取IBDVVP2基因保守位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，則有效克服了這一問(wèn)題。

大腸桿菌是一種條件性致病菌，當(dāng)機(jī)體受到應(yīng)激或其他病原體感染而免疫力下降時(shí)，就大量繁殖，引起發(fā)病。該起疫情就是由雞傳染性法氏囊病病毒首先感染，雞體免疫力下降后，繼發(fā)感染大腸桿菌引起的，這與雞群發(fā)病突然，病死率高相一致。

近年來(lái)，在養(yǎng)雞實(shí)踐中，多病原的多重感染或混合感染己是普遍發(fā)病的規(guī)律。雞群中發(fā)病，常常不是某單一的病原體引起，而是兩種以上的病原體共同作用造成的，即常稱的共感染，其結(jié)果造成病雞的高發(fā)病率和高死亡率，診斷和防治難度加大，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該起疫情就是由雞傳染性法氏囊病毒與大腸桿菌共同作用的結(jié)果。對(duì)這類疾病的診斷僅靠臨診癥狀和剖檢變化，沒(méi)法做出準(zhǔn)確診斷。因此，只有通過(guò)發(fā)病雞的流行病學(xué)、臨診癥狀和病理變化及實(shí)驗(yàn)室診斷，才能夠做出準(zhǔn)確的診斷，避免盲目采取措施，造成更大損失。

收稿日期：（2015-12-26）

中圖分類號(hào)：S858.31

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：

文章編號(hào)：1004-5090（2016）02-0043-02