反相高效液相色譜法測定接骨木籽油中維生素E的含量

劉克海 呂慧 駱蔚燕 董伶 劉克武

摘要 [目的]建立測定接骨木籽油中維生素E 含量的方法。[方法]采用反相高效液相色譜法，色譜柱為Kromasil C18柱，流動相為甲醇-水（98∶2），流速為1.0 ml/min，檢測波長280 nm，柱溫25 ℃。[結果]在上述條件下，維生素E在5～100 μg/ml范圍內呈良好的線性關系，平均回收率為99.29%，RSD=1.44% （n=5）。[結論]該方法操作簡便快捷、結果可靠、重復性好，適用于接骨木籽油中維生素E含量的測定。

關鍵詞 接骨木籽油;維生素E;反相高效液相色譜法;含量

中圖分類號 S567 ?文獻標識碼

A ?文章編號 0517-6611（2015）03-055-02

Determination of the Vitamin E in Sambucus Williamsii Seed Oil by Reversed-phase High-performance Liquid Chromatography

LIU Kehai¹，LV Hui¹，LUO Weiyan¹，LIU Kewu2* et al

（1.College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306;2.Heilongjiang Forest ByProduct and Speciality Research Institute，Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Nonwood Forest Product Development，Mudanjiang，Heilongjiang 157011）

Abstract ? [Objective] The research aimed to establish a method to determine the vitamin E in Sambucus Williamsii seed oil.[Method] Reversedphase highperformance liquid chromatography with Kromasil C18 column was used.Mobile phase was methanol and water （98：2，v/v） with a flow rate of 1.0 ml/min.UV detection wavelength was 280 nm and the temperature of the column was 25 ℃.[Result] There was a good linear relationship between 5-100 μg/ml of the vitamin E，the average recovery rate was 99.28% with the RSD of 1.44%.[Conclusion] This method was simple and quick，reliable with good reproduction，and suitable for the determination of the content of vitamin E in Sambucus williamsii seed oil.

Key words ? Sambucus Williamsii seed oil; Vitamin E; Reversedphase highperformance liquid chromatography; Content

基金項目 上海市科委工程中心建設項目（11DZ2280300）;黑龍江省森林工業總局攻關項目（sgzjY201402）。

作者簡介 劉克海（1977- ），山東日照人，副教授，在讀博士，從事海洋生物資源利用研究。*通訊作者，副研究員，從事新資源食品研究。

收稿日期 20141211

接骨木生長在我國的東北地區，是一種鄉土樹種，它幾乎遍及黑、吉、遼等北方各個地區。接骨木為忍冬科接骨木屬植物^[1]，屬落葉灌木，資源豐富，約有20余種，我國產有5～6種^[2]，主要分布于我國東北、華北及朝鮮、俄羅斯部分地區的丘陵地帶。接骨木適應性強，易于種植，為珍稀的野生木本油料植物。據文獻記載，接骨木性味甘、苦、平，無毒，具有接骨續筋、祛風利濕、活血止痛之功效^[3]，同時還具有抗炎、鎮痛活性、抗骨質疏松活性、抗氧化作用、抗糖尿病作用以及促進骨折愈合作用等^[2]，藥用歷史悠久，藥用價值廣泛。

接骨木籽的含油量很高，達35%～44%^[2]，其中具有抗血脂作用的ɑ亞麻酸含量較高^[4]。從接骨木籽提取的接骨木籽油，是一種呈橙黃色、澄清透明的油狀液體，具有濃郁香味，無異味。維生素E是該油中的天然抗氧化劑，其含量越高，接骨木籽油就越穩定。

維生素E，又名生育酚，是脂溶性的維生素，對人體具有重要的生理功能。維生素E不但可以維持人體的肌肉和生殖系統正常代謝，還可以維持中樞神經和血管系統的完整。此外，它還具有清除自由基的作用，可作為抗氧化劑使用^[5-6]。維生素E是廣泛存在于各類植物油脂中的，且其對機體有著重要的生理功效，所以分析接骨木籽油中維生素E的含量是很必要的，同時這也是衡量該油脂營養價值的一個參考標準。關于測定維生素E的方法主要有薄層層析法、氣相色譜法、比色法^[7]和高效液相色譜法，前3種方法均存在著處理樣品繁瑣、準確性差、靈敏度低、精密度低等缺點;而高效液相色譜法則彌補了上述方法的某些缺點，具有快速、準確、高靈敏度和高精密度等優點。目前，已有學者對接骨木籽油的理化常數、重金屬含量以及脂肪酸的組成進行了研究，并做了相應的含量測定，但還沒有文獻報道關于測定接骨木籽油中維生素E的含量。

因此，筆者首先采用超臨界二氧化碳萃取接骨木籽油，然后采用反相高效液相色譜法，以甲醇—水為流動相，采用外標法進行接骨木籽油中維生素E的含量測定，為其開發利用提供科學的依據。

1 材料與方法

1.1 儀器

日立 L2000高效液相色譜儀（日本），日立L2400紫外檢測器，日立L2130高通量泵;Kromasil C18柱（250×4.6 mm）;RE52C旋轉蒸發器（上海青浦滬西儀器廠）;Speed SFE2 超臨界二氧化碳萃取裝置（美國Applied Separations 公司）。

1.2 試劑 接骨木籽;維生素E標準品（美國Sigma公司）;甲醇為色譜純;正己烷、乙醚均為分析純;水為超純水，流動相經0.45 μm微孔濾膜減壓過濾。

1.3 超臨界二氧化碳萃取接骨木籽油

稱取10 g粉碎后的接骨木籽置于超臨界裝置的萃取釜里，然后在萃取壓力為40 Mpa、萃取溫度為40 ℃的條件下靜態萃取15 min后，再動態萃取3.5 h，得到接骨木籽油^[8-9]。

1.4 色譜條件

日本日立高效液相色譜儀（L2000）;色譜柱是以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的Kromasil C18柱（直徑4.6 mm，高250 mm）;賽多利斯十萬分之一電子天平CPA225D;流動相為甲醇—水（98∶2）;流速為1.5 ml/min;檢測波長280 nm;柱溫25 ℃，進樣量10 μl。

1.5 標準曲線的繪制

精密稱取維生素E標準品適量，加正己烷制成每1 ml含維生素E標品1 mg的溶液，即得維生素E標準品的標準溶液;然后分別取維生素E標準溶液50、100、250、750、1 000 μl，用正己烷稀釋定容至10 ml的棕色容量瓶內，制得5、10、25、75、100 μg/ml的維生素E標準溶液系列。在上述的色譜條件下進樣測定，記錄對應的維生素E的峰面積;最后以不同濃度的維生素E標準溶液的峰面積和對應的濃度作圖，繪制標準曲線。

1.6 精密度試驗 精密吸取維生素E標準溶液，重復進樣5次，求得維生素E標準品的峰面積的RSD。

1.7 重復性試驗

取同一批接骨木油樣品5份，按樣品測試條件進樣測定，求得維生素E含量的RSD。

1.8 樣品測定

超臨界CO₂萃取制得接骨木籽油，在避光條件下，取油樣約2 g，精密稱定，置50 ml分液漏斗中，用乙醚提取3次，每次10 ml，然后合并乙醚液，置于水浴上蒸干乙醚，殘渣用正己烷溶解，移至10 ml棕色容量瓶中，再用正己烷定容至刻度并搖勻。進樣前，將溶液經0.45 μm微孔濾膜過濾后再進樣。以上述色譜條件測定樣品溶液和標準品溶液，用外標峰面積法計算接骨木籽油中維生素E的含量^[10]。

1.9 加樣回收率試驗

精密稱取已知維生素E含量的接骨木籽油，約1.0 g，共取5份，分別精密加入標準品溶液（25 μg/ml）10 ml，置于20 ml棕色容量瓶中，加正己烷溶解至刻度，搖勻，然后精確移取2 ml溶液至10 ml的棕色容量瓶中，加正己烷定容刻度，密塞，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜過濾后進樣，分別在上述色譜條件測定維生素E的含量，計算回收率，回收率的計算公式為回收率=[（加標樣品的測定值-樣品測定值）/加標溶液的理論值]×100%。

2 結果與分析

2.1 超臨界二氧化碳萃取接骨木籽油

在萃取壓力為40 Mpa、萃取溫度為40 ℃的條件下靜態萃取15 min后，再動態

萃取3.5 h，得到接骨木籽油的產率為29.64%，相對標準偏差為0.41%。

2.2 標準曲線

以維生素E的峰面積對相應的濃度作圖繪制得到標準曲線（圖1）。結果表明，維生素E在濃度為5～100 μg/ml范圍內呈良好的線性關系。此外，得到峰面積（y）與濃度（x）的回歸方程為y=2 440.4x-1 351.4（R²=0.999 9）。

圖1 維生素E標準品的標準曲線

2.3 精密度試驗

精密吸取維生素E標準品溶液，重復進樣5次，求得標準品的峰面積的RSD為0.43%。

2.4 重復性試驗

取同一批接骨木油樣品5份，按樣品測試條件進行測定，求得維生素E含量的RSD為1.17%。

2.5 樣品測定

取同一批接骨木籽油5份，按照“1.8”中的方法處理后，在“1.4”色譜條件下進行測定，并計算。用外標峰面積法計算接骨木籽油中維生素E的含量。從維生素E標準品和樣品的HPLC圖譜（圖2）可以看出，樣品中維生素E的保留時間tR =29.29 min，與標準品tR基本相同。根據標準曲線進行計算，得出這5份接骨木籽油中的維生素E含量

圖2 維生素E標準品（a）和接骨木籽油中維生素E（b）的HPLC圖譜

平均為25.92 mg/kg，RSD為0.43%。

2.6 加樣回收率

在已知含量的樣品中分別加入不同量的維生素E標準品，配制成加標樣品液。將加標樣品液分別在“1.4”色譜條件下測定維生素E的含量，并計算，結果得出（表1），平均的加樣回收率為99.29%，RSD為1.44%（n=5）。

3 討論

（1）該試驗結果表明，用反相高效液相色譜法測定接骨

從前后期產量分析來看，水肥一體化施肥方式可以有效地提高草莓的產量和品質，特別是處理③即水肥一體化采用10 d 1次20-10-20加菌肥^[4]配方的施肥方式增產效果最佳，增產達46.0%，尤其是對后期的增產效果更明顯。這可能是因為普通施肥方式后期易造成脫肥，肥量不足，導致后期采收的產量明顯減少;而處理③有效彌補了這一缺陷，有效滿足大棚草莓生長發育的需肥規律，從而更有效地激發出大棚草莓的生產潛力。

參考文獻

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