藥用植物毛狀根技術的研究

李文龍 王媛媛 張芳芳 劉淑靜 劉宇 張東吉 張躍華

摘要 闡述了發根農桿菌的作用機理，對毛狀根誘導過程中外植體、發根農桿菌種類、預培養及共培養時間、外源激素添加、酚類物質添加及培養條件等因素對誘導率的影響進行系統的論述，并對藥用植物毛狀根的鑒定方法及在次生代謝物的合成機制研究及生產、藥用植物基因工程、新藥物的產生、藥物蛋白生產等方面的應用進行概述。

關鍵詞 藥用植物;發根農桿菌;毛狀根

中圖分類號 S567 ?文獻標識碼 A ?文章編號 0517-6611（2015）03-044-03

Study on Hairy Roots of Medicinal Plant Technology

LI Wenlong¹， WANG Yuanyuan¹， ZHANG Fangfang¹， ZHANG Yuehua2* et al

（1. College of Life Sciences of Jiamusi University， Jiamusi， Heilongjiang 154007; 2. Faculty of Science， Jiamusi University， Jiamusi， Heilongjiang 154007）

Abstract This paper describes the action mechanism of Agrobacterium rhizogene，effects of explants， Agrobacterium rhizogene species， preculture and coculture time， exogenous hormones， polyphenols and culture conditions on the induction rate during hairy roots induction process were elaborated. The identification method of medicinal plants hairy roots， and the application in synthesis mechanism and production of secondary metabolites， the medicinal plant gene engineering， development of new drugs， pharmaceutical protein production were reviewed.

Key words Medicinal plants; Agrobacterium rhizogenes; Hairy roots

基金項目 佳木斯大學校長創新創業基金項目（xzyf201308）。

作者簡介 李文龍（1990- ），男，山東曹縣人，本科生，專業：生物技術。*通訊作者。

收稿日期 20141205

發根農桿菌（Agrobacterium rhizogenes）是一種土壤細菌，具有廣泛侵染性，能夠誘導植物形成毛狀根，Hildebrand于1934年在對蘋果樹的研究中闡述了該現象^[1]。發根農桿菌攜帶的Ri質粒侵染植物后，雙子葉植物大多數能夠誘導出毛狀根，而單子葉植物只有少數能夠在感染部位長出毛狀根。發根農桿菌誘導產生的毛狀根具有次生代謝物高且可以穩定存在，還具有生長速度快和易獲得再生植株等優點。毛狀根技術被應用于藥用植物的研究，成為藥用植物研究的一個新方向。

1 發根農桿菌作用機理

發根農桿菌上含有一個巨大的侵入質?！猂i質粒，大小為200～800 kb，其上含有2個與轉化有關的區域：Vir區（致病區）和TDNA區（轉移區）。發根農桿菌作用于藥用植物，感染后可在傷口部位誘導出毛狀根就是由發根農桿菌Ri質粒上的TDNA區和Vir區來實現的。在自然狀態下，發根農桿菌上的Ri 質粒作為基因載體可以直接作用于藥用植物傷口處細胞;在藥用植物傷口組織處會產生乙酰丁香酮等酚類化合物及多糖物質，能夠誘導Ri質粒內vir基因表達;vir基因表達產物再作用于TDNA區，使TDNA區的DNA片段能插入整合到藥用植物的基因組，DNA片段整合到宿主細胞后表達，促使傷口處組織分化產生大量毛狀根^[2]。

2 藥用植物毛狀根誘導及鑒定

藥用植物毛狀根誘導常用的方法有3種，即直接接種法、外植體共培養法、原生質體共培養法。直接接種法：利用藥用植物種子獲得無菌苗，在莖上劃出傷口，將活化好的農桿菌接種到傷口上，繼續培養一段時間后就會從傷口處長出毛狀根，此種方法最為簡單便捷。外植體共培養法：取藥用植物的葉片、葉柄或莖段等無菌外植體與活化好的發根農桿菌進行共培養，共培養2～3 d后，在加有抗生素的培養基上繼代培養，除掉發根農桿菌，一段時間后在外植體切口處長出毛狀根。原生質體共培養法：獲得藥用植物原生質體，與活化好的發根農桿菌共培養，然后在加有抗生素的培養基上篩選，最后在分化培養基上獲得完整毛狀根或植株，該方法對原生質體要求高且篩選和除菌較麻煩。

誘導出的藥用植物毛狀根大多具有分支多、大量白色根毛、失去向地性生長、液體培養速度快于正常根的特點，因此，可以根據毛狀根的特性從形態學水平上對毛狀根進行鑒定。藥用植物被感染細胞將發根農桿菌Ri質粒上的T-DNA整合后，在細胞內會形成特異的冠癭堿，利用硝酸銀試劑或磷鉬酸試劑染色法和高壓紙電泳法^[3-6]檢測藥用植物毛狀根中是否含有冠癭堿，從細胞水平上判斷是否轉化成功。此外，還可以利用PCR擴增技術從分子水平上對誘導出的毛狀根進行鑒定。

3 影響毛狀根誘導的因素

3.1 外植體

在藥用植物毛狀根誘導時，外植體的選取十分關鍵。同一種發根農桿菌感染，不同藥用植物同一外植體或同種藥用植物的不同外植體及同一藥用植株的不同發育階段的外植體轉化率都存在顯著差異。同一種發根農桿菌對同屬植物不同植株的同一外植體進行感染，轉化效率由于植株種類存在明顯差異。劉傳飛等^[7]在發根農桿菌對同屬植物作用的研究中，用R1601菌株同時感染3種葛屬植物，發現三裂葉葛、野葛和山葛葉片毛狀根的誘導率分別為28%、15%和17%。同一種發根農桿菌感染同種藥用植株時，一般葉片的轉化率會高于莖和葉柄，幼嫩植物組織器官的轉換率會高于發育成熟的植物組織器官。王莉等^[8]在何首烏毛狀根培養的研究中，利用發根農桿菌LBA9402對何首烏葉、葉柄和莖切段分別進行感染，結果發現葉柄和莖的誘導率分別為66.7%和46.7%，而葉的誘導率高達100%。胡忠等^[9]在枸杞發根農桿菌轉化系建立的研究中發現，枸杞的毛狀根誘導頻率與外植體的發育年齡和生理狀態密切相關。

3.2 菌株種類

不同菌種的發根農桿菌對于同種藥用植物轉化率不同。劉峻等^[10]在人參Ri質粒轉化系統建立的研究中，分別使用發根農桿菌15834、LBA918、A4、R1000、1601感染人參外植體，結果有15834菌株可誘導出人參毛狀根，證明不同發根農桿菌菌株對同一藥用植株致根能力不同。一般發根農桿菌中的堿型菌比甘露堿型菌株具有更廣泛的寄主范圍，如LBA9402、A4、1601、8196、15834等常用的堿型菌。Hamill等^[11]利用發根農桿菌堿型菌株LBA9402進行誘導試驗，結果發現雙子葉植物大多都能誘導產生毛狀根。

3.3 預培養及共培養時間

藥用植物外植體在感染發根農桿菌之前，接種到空白培養基預培養一定時間，可以提高轉化率并解決外植體傷口處細胞因過敏反應導致的褐化問題。因為在預培養過程中，外植體傷口能夠形成乙酰丁香酮等物質并釋放出誘導發根農桿菌識別的信號分子。TDNA由發根農桿菌Ri質粒上轉移并整合到受感染細胞DNA上需要一定的時間，所以，外植體與發根農桿菌共培養時間的長短直接影響到毛狀根的誘導率。在誘導藥用植物毛狀根時，要適當延長共培養時間，以提高轉化頻率。共培養時間過短，Ri質粒上的T-DNA還不能完成轉移與整合，則無法得到轉化的毛狀根;共培養時間過長，發根農桿菌增長過量易導致植物組織死亡。孫敏等^[12]在長春花轉化毛狀根誘導的研究中發現，當預培養2 d時轉化頻率最高達到44.44%，當共培養2 d時轉化頻率最高達到50.70%。

3.4 外源激素

藥用植物毛狀根誘導時，在培養基中加入一定量的外源激素，會使外植體傷口處細胞對發根農桿菌比較敏感，從而提高轉化頻率。劉峻等^[10]在人參毛狀根系轉化系統研究中發現，外植體在含NAA 3×10-6 mg/L、KT 0.3×10-6 mg/L的培養基中愈傷化程度最高，轉化頻率也最高，達到58%。王沖之等^[13] 在Ri質粒轉化西洋參的研究中發現，西洋參外植體在添加2，4D 1 mg/L、KT 0.1 mg/L的MS瓊脂培養基上培養，難以誘導出毛狀根，而在添加NAA 6 mg/L的MS瓊脂培養基中共同培養，成功誘導出毛狀根。

3.5 酚類物質

毛狀根誘導發生過程中，植物外植體的傷口處會分泌某些酚類物質，這些酚類物質能夠引起Vir區基因的活化，從而提高毛狀根的轉化頻率。因而，可以人為地在誘導過程中加入促進轉化的酚類物質來提高轉化頻率。目前廣泛使用的酚類物質有乙酰丁香酮、香草酚、羥基乙酰丁香酮等。添加適量的乙酰丁香酮可以提高轉化頻率，但對有些藥用植物誘導不僅無效且會有毒害作用。劉峻等^[10]在進行人參轉化系統的研究中發現，植株幼莖經1×10-4 mol/L的乙酰丁香酮處理后，轉化頻率明顯提高。

3.6 培養條件

在毛狀根誘導過程中，溫度和光照也是重要的外界影響因素。發根農桿菌的增殖和活力對外界溫度變化十分敏感。25～30 ℃發根農桿菌的增長最快，在28 ℃時，vir基因表達能力最強，適當調節溫度，可以提高轉化頻率。毛狀根誘導過程中光照時間的長短也會影響誘導率，大多數植物毛狀根的誘導在黑暗條件下進行，而黃遵錫等^[14]研究發現紫苑毛狀根在12 h/d光照條件下的誘導頻率比黑暗條件下高，在全天24 h光照條件下短葉紅豆杉毛狀根的誘導效果最佳。

3.7 其他因素

藥用植物毛狀根誘導頻率除以上幾種因素外，還受到其他因素的影響。MS、LS等高鹽培養基有助于毛狀根的形成;培養基中糖類物質的含量會影響毛狀根的誘導率;超聲波和真空滲透處理藥用植物材料能增加農桿菌與藥用植物外植體之間的接觸面積，提高轉化頻率;適當的菌種濃度也會提高轉化頻率，發根農桿菌菌種濃度在660 nm下的吸光度為0.5～0.8時，轉化頻率顯著提高;共培養后除菌時抗生素種類和濃度的不同對轉化頻率有一定的影響;培養基的pH及NH₄NO₃含量對毛狀根的轉化頻率也有一定的影響。

4 藥用植物毛狀根的應用

20世紀80年代毛狀根技術出現后受到高度重視，90年代起，藥用植物毛狀根的研究開始趨熱。統計數據表明，成功誘導出毛狀根的藥用植物已有近百余種，其中76%為草本植物，7%為藤本植物，其余17%為木本植物。近十幾年來，人們不僅從人參、丹參、甘草、青蒿等數十種藥用植物中誘導出毛狀根，而且對培養條件、基因導入機理及有效藥用成分含量進行了較為系統的研究。藥用植物起藥效作用的一般都是其次生代謝產物，藥用植物的毛狀根具有次生代謝產物含量高且穩定、生長快的特點，且毛狀根可以產生生物堿、蔡醒、皂普、蔥釀、多糖類、蛋白等代謝產物。藥用植物毛狀根主要應用在次生代謝物的合成機制研究及生產、藥用植物基因工程、新藥物的產生及藥物蛋白生產。