基于單因素試驗的大豆CDDPPCR反應體系優化

李強 高聚林 蘇二虎 廉博 牛敏 邵志壯 謝田

摘要 [目的] 優化大豆CDDP-PCR反應體系。[方法]采用單因素試驗方法對影響大豆CDDPPCR反應的Mg²⁺濃度、Taq DNA 聚合酶用量、引物濃度、dNTPs濃度和模板DNA用量等因素進行優化。[結果]優化后的大豆CDDPPCR體系為：Mg²⁺濃度2.0 mmol/L、Taq聚合酶用量1.5 U、引物濃度0.375 μmol/L、dNTPs濃度0.3 mmol/L、DNA模板用量40 ng。運用24個大豆品種驗證了該反應體系穩定、可靠。[結論]該反應體系的建立為大豆種質遺傳多樣性分析、遺傳連鎖圖譜構建及分子標記輔助育種奠定了基礎。

關鍵詞 大豆;CDDP;單因素試驗;體系優化

中圖分類號 S565.1 ?文獻標識碼 A ?文章編號 0517-6611（2015）03-032-03

Optimization of CDDPPCR System by Single factor Experiment Design in Soybean

LI Qiang¹， GAO Julin²， SU Erhu¹et al

（1.Inner Mongolia Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences， Huhhot， Inner 010031;2. College of Agronomy， Inner Mongolia Agricultural University， Huhhot， Inner 010019）

Abstract [Objective] The aim was to optimize CDDPPCR system by single factor experiment design in soybean. [Method] Single factor experiment design were applied to optimize CDDPPCR amplification system of soybean in five factors such as Mg²⁺， Taq DNA polymerase， primer， dNTPs and template DNA. [Result]The suitable reaction system was obtained， that is 20 μl containing 2.0 mmol/L Mg²⁺， 1.5 U Taq polymerase， 0.375 μmol/L primer， 0.3 mmol/L dNTPs， 40ng DNA template. The optimized CDDPPCR system was tested on 24 soybeans， and the result was stable and reliable. [Conclusion]The system provides the basis for evaluation of genetic diversity， construction of genetic linkage map and molecular marker assisted breeding for the soybean.

Key words Soybean; CDDP; Single factor experiment; System Optimization

基金項目 內蒙古自治區科技創新引導獎勵資金項目（20111707）;內蒙古農牧業科學院青年創新基金項目（2014QNJJN01）。

作者簡介 李強（1982- ），男，內蒙古巴彥淖爾人，助理研究員，博士，從事大豆育種、栽培研究。

*通訊作者，研究員，從大豆育種、栽培研究。

收稿日期 20141215

大豆是世界上重要的糧食、油料、飼料兼用作物，是人類食用油和植物蛋白的主要來源^[1]。大豆起源于我國，具有悠久的栽培歷史，經過長期自然與人工選擇，產生了豐富的遺傳變異類型。但品種退化、品種混亂嚴重給種質區分和大豆育種工作帶來了諸多困難，而分子標記技術可有效地進行品種鑒定、遺傳多樣性研究，并能指導育種實踐^[2]。前人已先后應用RAPD^[3]、AFLP^[4]、SSR^[5]、ISSR^[6]、SRAP^[7]等分子標記技術對大豆種質遺傳多樣性、親緣關系鑒定及雜交后代鑒定等方面進行了研究。但這些標記技術都是傳統意義上的隨機DNA分子標記，隨著植物基因組學和大規模測序技術的深入發展，NCBI、SOYBASE、GDB等公共基因組、蛋白組數據庫信息爆炸式增長，研究者應用這些DNA/ cDNA相關序列信息設計、開發了一大批目的基因分子標記，這類標記與目標基因關聯密切，針對性強、效率高，且該類技術在不同物種間可以通用^[8]。目的基因分子標記技術有利于實現對植物特定性狀進行標記，對重要性狀QTL定位研究也具有特殊價值。因此，建立一套簡單、有效、實用的目的基因分子標記技術對大豆親緣關系鑒定、遺傳多樣性及分子標記輔助育種具有重要意義^[9]。

來源保守DNA序列多態性（Conserved DNA-derived polymorphism，CDDP）標記是2009年Collard等^[10]提出的一種基于DNA保守序列的新型目的基因分子標記方法。其原理是根據一些功能得到驗證的重要基因或基因家族中的保守氨基酸序列對應的DNA保守序列在不同物種間也是相當保守的，利用多重比較軟件（CLUSTAL W、Genedoc、DNAman等）對來自不同物種的功能基因序列或功能蛋白質序列進行多重比較，找出不同物種中同時存在的保守DNA或蛋白質序列，為引物的設計提供錨定位點。目前國內外CDDP分子標記應用很少，僅在水稻^[10]、歐白英^[11]、牡丹^[12]、菊花^[13]等作物上成功應用，利用正交設計建立了大豆CDDP-PCR反應體系^[14]，筆者以大豆為材料，采用單因素試驗方法進一步優化大豆CDDP-PCR反應體系，對正交設計試驗進行驗證，建立一套穩定、有效的標記體系，為研究大豆的遺傳多樣性、遺傳圖譜構建及分子標記輔助育種提供新的技術手段。