紅景天提取物對3T3睱1脂肪細胞增殖及細胞分化的影響

李新明 高忠東等

摘要

[目的]應用3T3L1前脂肪細胞株，分析紅景天提取物（Rhodiola rosea L. herb extract， RRLHE）對3T3L1細胞增殖和分化的作用。[方法]使用油紅O染色法對紅景天提取物干預分化的細胞進行評估并定量分析脂肪細胞分化程度。通過逆轉錄多聚酶聯反應（RT-PCR）來檢測脂肪細胞分化相關基因過氧化物體增殖劑活化受體γ（PPARγ）、CAAT/增強子結合蛋白α（C/EBPα）mRNA的表達。[結果]紅景天提取物能顯著抑制3T3L1細胞增殖和向成熟脂肪細胞分化，另外，紅景天提取物能顯著提高3T3L1前脂肪細胞的葡萄糖攝取和利用率，紅景天提取物明顯抑制PPARγ、C/EBPα mRNA表達，與對照組比較，差異顯著（P<0.01）。[結論]紅景天提取物對3T3L1細胞增殖和分化均有抑制作用，并能提高3T3L1前脂肪細胞的葡萄糖攝取和利用率，其影響機制與鈍化 PPARγ、C/EBPα mRNA 的表達有關系。

關鍵詞 紅景天提取物；3T3L1；細胞分化；PPARγ mRNA

中圖分類號 S188 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）05-025-02

Effects of Rhodiola rosea L. Herb Extract on 3T3L1 Proliferation and Differentiation

LI Xinming， GAO Zhongdong， LI Qun et al

（Processing Institute of Shanxi Academy of Agricultural Sciences， Taiyuan， Shanxi 030031）

Abstract [Objective] Preadipocyte 3T3L1 was used to evaluate the effect of Rhodiola rosea L. herb extract （RRLHE） on preadipocyte 3T3L1 proliferation and differention. [Method] Oil red O staining method was used for evaluation of effect of Rhodiola rosea L. herb extract （RRLHE） on preadipocyte 3T3L1 proliferation and differention. Adipocyte differentiation related genes expression， peroxisome proliferation activator receptor γ（PPARγ） and CAAT/enhancer binding protein α（C/EBPα） mRNA， were examined by using the reverse transcription polymerase chain reaction （Real time QPCR）. [Result] RRLHE could significantly inhibit preadipocyte 3T3L1 proliferation and differention toward mature adipocytes. In addition， RRLHE could significantly increase 3H glucose uptake rate in preadipocyte 3T3L1. RRLHE could significantly inhibit PPARγ and C/EBPα mRNA expression compared to control group. [Conclusion] RRLHE can inhibit preadipocyte 3T3L1 proliferation and differention toward mature adipocytes， enhance 3H glucose uptake rate in preadipocyte 3T3L1. The inhibitory effect has a relationship to deactivation of PPARγ and C/EBPα mRNA genes expression.

Key words Rhodiola rosea L. herb extract； 3T3L1； Cell differentiation； PPARγ mRNA

作者簡介

李新明（1970-），男，陜西西安人，副研究員，從事食品科學研究。

收稿日期 20141229

紅景天是景天科（Crassulaceae）紅景天屬（Rhodiola L.）多年生草本或亞灌木植物。紅景天中含有多種化學成分，主要有黃酮類、酪醇、紅景天苷、谷甾醇、有機酸、揮發油、多糖、脂肪、蛋白質等，具有增強免疫功能，保護心腦血管等功效[1-2]。

筆者從與脂肪細胞分化密切相關的2個因子過氧化物體增殖劑活化受體γ（peroxisome proliferator activated receptor PPARγ）和CAAT/增強子結合蛋白α（CAAT/enhancer binding protein C/EBPα）入手，觀察了紅景天提取物對其mRNA表達的影響，為深入探討紅景天提取物改善脂代謝的機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

紅景天提取物為山西省農業科學院制備。

3T3L1前脂肪細胞株購自American Type Culture Collection （ATCC）。其他試劑為Amresco公司產品或購自Sigma公司。

1.2 3T3L1前脂肪細胞的增殖及檢測

前脂肪細胞（3T3L1）分為對照組（不加藥）和藥物處理組。不同濃度前脂肪細胞（3T3L1）接種在96孔板上，參照XTT法描述，測定吸光度值（A570），建立細胞數目曲線。然后再將1.5×104/ml濃度的前脂肪細胞3T3L1接種于96孔板，每孔為100 μl培養基，在細胞貼壁后，加變化濃度的RRLHE（100、150、200 μg/ml）進行干預培養，分別檢測各組細胞的A570值，通過“A570值細胞數目”曲線計算每加藥24、48和72 h的細胞數目。

1.3 紅景天提取物對前脂肪細胞3T3L1葡萄糖攝取率的影響

3T3L1前脂肪細胞經培養和誘導分化為成熟的脂肪細胞后。將成熟的脂肪細胞以含0.2%牛血清白蛋白（BSA）的DMEM培養基培養12 h后，分為4組：對照組（不加RRLHE）、低中高（100、150、200 μg/ml）劑量RRLHE處理組，藥物處理培養24 h。按文獻[3]所述方法測定3H葡萄糖攝取率。

1.4 3T3L1前脂肪細胞的培養、誘導分化和定量檢測

將3T3L1前脂肪細胞按文獻[4]所述方法進行誘導分化，誘導分化8～12 d的3T3L1細胞85%以上呈脂肪細胞表型。

設置空白對照組（normal control，CON組）、紅景天提取物干預組[RRLHE組（100、150、200 μg/ml）]及羅格列酮干預組（ROS組），在培養液中分別加入不同濃度的干預藥物。羅格列酮為10 μmol/L，CON組加等體積生理鹽水。分化液與藥同時加入，同步更換藥物與培養液。分化第8天開始油紅O染色，拍攝照片。異丙醇處理已染色的細胞，在細胞裂解后通過酶標儀對脂滴著色程度進行比色，檢測OD值（570 nm波長），定量分析細胞的分化程度。

1.5 實時定量PCR檢測PPARα和C/EBPα基因在3T3L1細胞中的表達

引物設計：PPARγ上游5′TTTCAAGGGTGCCAGTTT3′，下游5′AGGCCAGCATCGTGTAG3′，C/EBPα上游5′GGAAAGAAACGACTGGGAGC3′，下游5′CGACTAGACGCTATTGTGATT3′，GAPDH上游5′ATGAGGTCCACCACCCTG3′，下游5′TTGACCTCAACTACATGG3′；使用Trizol試劑從細胞中提取總RNA，通過寡脫氧核苷酸和MMLV逆轉錄酶合成cDNA，采用Tag DNA多聚酶PCR反應擴增cDNA產物，應用ABIPRISM 7000序列檢測系統測定mRNA拷貝和循環數的線型關系，設定標準曲線。將正常對照組mRNA的表達量設為1，計算各組mRNA的相對表達量。

1.6 數據處理

采用SPSS12.0軟件進行數據分析，結果用（x±SD） 表示，并進行組間差異比較，當P<0.05時表明差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 紅景天提取物對前脂肪細胞3T3L1增殖的影響

在空白對照組，3T3L1前脂肪細胞數量在24、48、72 h呈倍數增長；與空白對照組比較，100、150、200 μg/ml RRLHE作用后（24、48、72 h），明顯抑制了脂肪細胞的增值，且有一定的劑量依賴關系（5.29±0.17、4.72±0.09、4.48±0.11 vs 5.35±0.12； 8.05±0.13、7.66±0.12、6.84±0.15 vs 8.79±0.07； 15.73±0.43、15.47±0.31、15.04±0.29 vs 16.05±0.34），即RRLHE濃度越高則抑制作用越明顯，與對照組比較差異有統計學意義（表1，P<0.05，P<0.01）。

油紅O脂肪特異性染色結果發現，相比較對照組，RRLHE處理組細胞內亮紅色的脂滴顯著減少，充脂細胞數和細胞體積也隨之降低，相比較對照組，羅格列酮處理組OD值也顯著增加，羅格列酮組分化成典型的成熟脂肪細胞形態，細胞圓而大，胞內充滿了脂滴。意味著高濃度RRLHE可顯著降低脂肪細胞內脂肪的生成量，對3T3L1前脂肪細胞向成熟脂肪細胞分化具有顯著的抑制作用。

2.2 紅景天提取物對前脂肪細胞3T3L1 3H葡萄糖提取率的影響

紅景天提取物對前脂肪細胞3T3L1 3H葡萄糖攝取率的影響見圖1，與對照組相比較（Con組葡萄糖攝取率當作參考對照基值（100%），其他藥物處理組分別與CK組相比較當作各組的葡萄糖攝取率。），RRLHE處理組細胞內3H葡萄糖攝取率隨藥物劑量的增加而顯著增加（108.8±2.6、117.6±4.1、122.1±3.5 vs 100±2.2），顯示出明顯的劑量依靠效應。

注：*P<0.05，**P<0.01。

2.3 紅景天提取物對前脂肪細胞3T3L1中PRARγ和C/EBPα mRNA表達的影響

RRLHE對脂肪細胞PPARγ和C/EBPα mRNA表達的影響見表2，RRLHE組PPARγ mRNA和C/EBPα mRNA表達量顯著低于對照組（0.85±0.03 vs 1.00±0.1； 0.83±0.04 vs 1.00±0.1），與對照組相比，羅格列酮組的PPARγ mRNA和C/EBPα mRNA表達量顯著增加（2.51±0.09 vs 1.00±0.1； 2.44±0.11 vs 1.00±0.1）（表2，P<0.01）。

3 討論

紅景天具有許多生物活性，如改善血液微循環、活血化瘀和緩解高原缺氧、促進體脂和膽固醇代謝，減輕高脂血癥的作用。大量動物試驗已經證明了紅景天提取物降低動物高脂血癥的效果[5]。紅景天提取物在臨床上廣泛應用于高脂血癥的治療[6]。在目前的試驗中，紅景天提取物能夠降低3T3L1前脂肪細胞增殖和向成熟脂肪細胞分化，結果從細胞水平證明了紅景天提取物能夠調節脂代謝紊亂。另外，紅景天提取物處理能夠顯著增加前脂肪細胞3T3L1內3H葡萄糖攝取率，這一效果隨藥物劑量的增加而增加，表明紅景天提取物在一定程度上能夠減輕胰島素抵抗效應。這表明紅景天提取物可以提高葡萄糖攝取和利用，但不會增加體脂的聚積，從而不會引起體重的過度增加。

作為脂類代謝的重要調節因子，PPAR在調控能量代謝方面起重要作用，能夠調解脂肪酸吸收、脂肪沉積和形成、脂類代謝內環境和胰島素抵抗[7]。在脂肪組織、小腸上皮細胞、骨骼肌和淋巴等多種器官及組織中，PPARγ廣泛表達[7]。C/EBPα屬于亮氨酸拉鏈轉錄因子家族，可誘導成纖維細胞中的脂肪形成。活化的C/EBPα單獨能增加自身的表達，同時還能夠與PPARγ協同誘導細胞分化[8]。該研究表明，紅景天提取物能夠抑制3T3L1前脂肪細胞中PPARγ mRNA和C/EBPα mRNA的表達，這與羅格列酮的作用相反，推測紅景天提取物作為 PPAR 的配體，激活和活化了 PPAR 受體，提高了肝臟PPARγ mRNA、PPARα mRNA 的表達，進而啟動了下游與脂質代謝有關酶的一系列基因轉錄，加速了脂肪氧化

分解，從而改善了脂質代謝紊亂，這可能是紅景天提取物改

善脂質代謝紊亂的作用機理之一。

推測紅景天提取物通過降低 PPARγ、C/EBPα mRNA 的表達來抑制脂肪細胞的分化，進而抑制脂質在脂肪細胞內的積聚和前脂肪細胞向成熟脂肪細胞分化，增加葡萄糖的攝取和利用、抑制體脂的積聚，最終延緩體重的增加，從而其脂類和糖類代謝的改善作用。

參考文獻

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安徽農業科學，Journal of Anhui Agri. Sci.2015，43（5）：140-141

責任編輯 喬利利 責任校對 李巖