不同生境具抑菌作用的海洋真菌篩選

林映瑩 趙喚閣等

摘要 [目的]為了測定海口沿海海域不同生境的海洋真菌抑菌狀況。[方法]從海口西海岸沿線、南渡江入海口以及演豐紅樹林3個生境分離到162株海洋真菌，通過藥敏紙片法測定海洋真菌代謝產(chǎn)物對4株病原細菌的抑菌活性。[結(jié)果] 82.72%的海洋真菌具有不同程度的抑菌作用，其中分離自紅樹林生境的海洋具有抑菌作用的程度最高，西海岸生境分離的真菌次之，入海口生境分離的海洋真菌具有抑菌作用的概率相對最低。[結(jié)論]從不同生境分離到的海洋真菌，其抑菌效果也不一樣。因此，當需要篩選某種活性的海洋真菌時，可到具有較易篩選出該活性的生境中篩選。

關鍵詞 海口；海洋真菌；生境；抑菌活性；藥敏紙片

中圖分類號 S931.3 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）05-004-03

Screening of Marine Fungi in Different Habitats with the Antibacterial Activity

ZHOU Songlin1，2， LIN Yingying1， ZHAO Huange1 et al

（1. Hainan Provincial Key Laboratory of Tropical Medicine， Hainan Medical College， Haikou， Hainan 571199； 2. College of Life Sciences， Nanjing Normal University， Nanjing， Jiangsu 210046）

Abstract [Objective] To determinate the inhibitory condition of marine fungi coastal waters of Haikou in different habitats. [Method] 162 strains of marine fungi were isolated from three different habitats along the west coast of Haikou， Nan Dujiang mouth out， and Yan Feng mangrove， and the antibacterial effects of marine metabolites on the 4 strains of pathogenic bacteria were measured by KB assay. [Result] The present study showed that 82.72% of total marine fungi have different degreed bacteriostasis， which isolated from the mangrove habitat fungi have highest antibacterial activity， and second was isolated from habitat at the west coast of Haikou， and lowest antibacterial activity were isolated estuariy habitat marine fungi. [Conclusion] So the metabolism products of islolated from difenent habitats fungi have diffennt degree antibacterial activity， and we can conclude that screening target strains should from the purpose of habitat.

Key words Haikou； Marine fungi； Habitats； Antibacterial activity； Drug sensitive slips

作者簡介 周松林（1979- ），男，湖南邵陽人，博士研究生，研究方向：微生物學。

收稿日期 20141224

海洋環(huán)境具有高壓、高鹽、低溫、低光照、寡營養(yǎng)、低溶氧等特點。為了適應這樣的生存環(huán)境，海洋生物在新陳代謝、生存繁殖方式和適應方式等方面產(chǎn)生了與陸地生物有所不同的代謝系統(tǒng)以及機體防御系統(tǒng)[1]。但是，由于地球的海陸分布不均，海洋生態(tài)環(huán)境實際上也是由許多不同的生境組成的，因此在不同生境下蘊育著不同的微生物種群[2]。自從1945年意大利人Brotzu[3-4]在撒孢丁島城市排污口附近的海水發(fā)現(xiàn)一株產(chǎn)頭孢菌素 C的頂頭孢霉（Cephalosporium acremonium），對海洋真菌的研究腳步就一刻也沒有停止過。特別是近10年以來，每年都從海洋真菌中發(fā)現(xiàn)的大量結(jié)構(gòu)新奇、具有抑菌、抗腫瘤、抗病毒的新的代謝產(chǎn)物為新藥研發(fā)提供了大量的先導化合物[5-7]。以海口沿海海域3個不同的海洋生境（即西海岸沿線的海灘、港口碼頭，南渡江入海口區(qū)域和演豐鎮(zhèn)紅樹林）為采集目的地，筆者分離其海洋真菌，并檢測其發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌活性。

1 材料與方法

1.1 抑菌所用指示菌株

金黃色葡萄球菌（Staphlococcus aureus）、銅綠假單胞桿菌（Pseudomonas aeruginosa）、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）、大腸桿菌（Escherichia coli），均為實驗室保存菌種。

1.2 培養(yǎng)基

真菌培養(yǎng)基為通用液體（固體）培養(yǎng)基，組成為：葡萄糖10 g、蛋白胨2 g、酵母膏1 g、（瓊脂20 g）、陳海水600 ml，蒸餾水定容至1 L，自然pH，121 ℃高壓滅菌20 min。

細菌培養(yǎng)基為LuriaBertani（LB）液體（固體）培養(yǎng)基，組成為：蛋白胨10 g、酵母膏5 g、NaCl 10 g，蒸餾水定容至1 L，121 ℃高壓滅菌20 min。

1.3 海洋真菌的分離

1.3.1 樣品采集。在2011年9月～2012年10月從海南省海口市西海岸淺海域的3處不同海洋生境（西海岸沿線、南渡江入海口、演豐紅樹林）采集海洋漂浮腐枝枯葉和泥沙樣品。樣品采集后，用冷藏箱低溫保藏，帶回實驗室再進行菌株分離。

1.3.2 樣品真菌的分離。

1.3.2.1 腐枝枯葉的處理。將采集回來的樣品先用無菌水清洗數(shù)次后用剪刀剪成邊長為0.5 cm的正方形小片，然后分別用濃度1%的生汞浸泡30 s，濃度75%的酒精浸泡45 s，最后用無菌水清洗3次，用無菌鑷子將小片均勻地分布到培養(yǎng)皿上，在平均每個培養(yǎng)皿上放置6～7個樣品。將培養(yǎng)皿放置在25 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～5 d，直至長出菌落。

1.3.2.2 海水、泥沙的處理。泥沙、海水直接用無菌生理鹽水按1∶10的比例稀釋制成懸液便可，稀釋液涂布在平板上，至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～5 d，直至長出菌落。

1.4 海洋真菌的發(fā)酵產(chǎn)物抑菌作用的篩選

1.4.1 海洋真菌的發(fā)酵培養(yǎng)和提取物的制備。從平板培養(yǎng)基中接種適量真菌到裝有40 ml液體培養(yǎng)基的錐形瓶（150 ml）中，于25 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)15 d。發(fā)酵液經(jīng)凍融、研磨成勻漿后，加入等體積的乙酸乙酯進行振蕩萃取3次，合并上層萃取液。萃取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40 ℃下減壓濃縮后，至真空旋轉(zhuǎn)干燥儀上干燥后稱量。根據(jù)質(zhì)量的不同，用適量的丙酮溶解后得到10 mg/ml樣品待測物，測試其活性。

1.4.2 海洋真菌提取物抑菌活性的測定。海洋真菌抑菌活性的采用藥敏紙片法[8]。每張紙片加入5 μl的10 mg/ml代測藥品，對照紙片加入5 μl丙酮。試驗結(jié)果重復3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 海洋真菌的分離

從海口沿海3個不同的生境中共分離得到162株海洋真菌。不同樣品及生境分離得到的真菌數(shù)量見表1。

表1 海口沿海域海洋真菌分離的分布情況

生境泥沙、海水腐枝枯葉總計

海口西海岸沿海 2482106

南渡江出海口 61622

演豐紅樹林 132134

2.2 海洋真菌發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌活性

162株海洋真菌發(fā)酵粗提物對4株病原細菌的抑制結(jié)果見表2。在分離的所有海洋真菌中，只有28株海洋真菌代謝產(chǎn)物粗提取物對4種指示病原細菌均無抑制作用，占總數(shù)量的17.28%，但有42株真菌的代謝產(chǎn)物對4種病原細菌均有一定的抑制作用，占其總菌株的25.93%。其中，對金黃葡萄球菌物無明顯抑制效果的為51例，有非常強的抑制效果的有8例（抑菌圈≥15 cm）；對肺炎克雷氏伯菌無明顯抑制效果的為76例，有非常強的抑制效果的有9例；對銅綠假單孢菌無明顯抑制效果的為73例，有非常強的抑制效果的有5例；對大腸桿菌無明顯

抑制效果的為62例，有非常強的抑制效果的有6例。

3 討論

從海口沿海3個不同生境中分離得到162株海洋真菌，其中海口西海岸沿線路徑最長，包括沙灘、灘涂、海港，也是人口活動最多的地方，采集集的樣品最多，分離的菌株也最多；南渡江是海南省最大的淡水河流，有不少文獻報道淡水河進入大海的區(qū)域微生物數(shù)量和種類非常豐富[1-3]；演豐紅樹林在海口沿海線的東方，對于紅樹林來說，其真菌種類豐富，并且常常有新穎的活性化合物的報道[6-7]。但是，研究中分離的海洋真菌數(shù)量并沒有想象中的多，其原因部分是由于在同一樣品相同（似）的菌株只分離1株；另外，分離的通用培養(yǎng)基可能對紅樹林和河流入海口的真菌分離效果不佳；三是采集的樣品量太少等。

在分離的162株海洋真菌中，有28株海洋真菌代謝產(chǎn)物粗提取物對4種指示病原細菌均無抑制作用，占總數(shù)量的17.28%，其中沿海岸生境的有23株，入海口生境的占5株，分別占其總分離菌株數(shù)的21.70%、22.72%，而紅樹林分離到的34株真菌均至少對某一病原細菌有一定的抑制作用；在42株對4種病原細菌均有一定抑制作用的真菌中，紅樹林生境的有12株，西海岸生境的有27株，入海處生境的只有3株，分別占其分離總數(shù)的35.29%、25.47%和 13.64%；在23株至少對1種病原菌有強烈抑制作用的（抑菌圈直徑≥15 cm）海洋真菌中，紅樹林生境的為10株，西海岸沿線生境的為10株，如海口生境的為3株。這些表明從紅樹林分離的真菌更多的具有抑菌作用，其次是分離來自西海岸沿線生境的真菌，入海口生境再次之。

從抑菌效果來看，有4株海洋真菌對4種病原菌都較強抑制效果（抑菌圈≥10 cm）。它們分別為M22、M40、M46、M100，其中菌株M22發(fā)酵液對金色葡萄球菌有很強的抑制作用（抑菌圈≥15 cm），而菌株M40對克雷氏肺炎菌和大腸桿菌的也有很強的抑制作用。有7株對至少2種指示病原菌有很強的抑制效果（抑菌圈≥15 cm）。它們分別為 ZJ31、ZJ33、G21、M26、M40、M47、M105。因此，這10株海洋真菌可以作為種子菌株，作為開發(fā)新的抗生素備選目標的可能，但其代謝產(chǎn)物需要進一步研究。

參考文獻

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