復(fù)方利肝湯對急性肝損傷小鼠的保護作用研究

羅宇

摘要：目的：研究探討復(fù)方利肝湯對急性肝損傷模型小鼠的保護作用。方法：采用腹腔注射CCl4制備急性肝損傷小鼠模型，分別檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、乳酸脫氫酶（LDH）及小鼠肝組織總抗氧能力（T-AOC）和丙二醛（MDA），并進行肝臟組織病理評分，觀察復(fù)方利肝湯對肝損傷模型小鼠的影響，結(jié)果：復(fù)方利肝湯能顯著降低CCl4致肝損傷小鼠血清ALT、AST、LDH活性，明顯提高肝組織總抗氧能力，降低MDA，減輕CCl4對肝細胞的損害。結(jié)論：復(fù)方利肝湯對CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠有保護性作用。

關(guān)鍵詞：復(fù)方利肝湯；CCl4 ；肝損傷

ABSTRACT： Objective： To observe the protective effect of Compound Ligan Decoction on hepatic injury induced by carbon tetrachloride. Methods： The ALT，AST，ALP， LDH liver index，hepatic pathological change and impairs total antioxidant capabilities （T-AOC）、Hepatic malondialdehyde（MDA） were examined on hepatic injury induced group moreover compared with control group and Compound Ligan Decoction group. RESULTS： There were striking differences on hepatic injury induced group compared with control group and Compound Ligan Decoction group（p<0.05）.Compound Ligan Decoction could obviously reduce the level of ALT ，AST ， ALP，LDH and MDA induced by carbon tetrachloride and recover the hepatic injury.Conclusion： Compound Ligan Decoction has the protective effect on hepatic injury induced by carbon tetrachloride.

KEYWORDS：Compound Ligan Decoction；carbon tetrachloride；hepatic injury

復(fù)方利肝湯是由葛根、黨參、黃芩、刺五加、梔子等組成，具有疏肝理氣、清熱利濕、護肝解毒、益氣健脾、提高免疫力等功效，有廣泛的臨床應(yīng)用基礎(chǔ)。而CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷模型是應(yīng)用較為廣泛的研究肝保護藥物的動物模型。本研究探討復(fù)方利肝湯對CCl4致急性肝損傷小鼠的保護作用。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物

昆明系小鼠，5～8周齡，體重（20±2）g，雌雄各半，購自四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所，合格證號：SCXK（川）2013-18，恒溫25℃、相對濕度40-70%環(huán)境飼養(yǎng)，飼標準飼料。

1.1.2藥品與試劑

復(fù)方利肝湯，用水煎，濃縮至相對于生藥量為2.5g/ml，置4℃冷藏備用。利肝康片為云南昊邦制藥有限公司產(chǎn)品；生理鹽水購自四川科倫藥業(yè)股份有限責(zé)任公司；CCl4 （分析純）購自成都市聯(lián)合化工試劑研究所； AST、ALT、LDH檢測試劑盒購于四川邁克生物科技有限公司；總抗氧能力、MDA檢測試劑盒為南京建成生物工程公司產(chǎn)品；戊巴比妥鈉，北京化學(xué)試劑公司

1.1.3儀器

OLYMPUS DP71病理顯微攝影，日本奧林巴斯光學(xué)工業(yè)株式會社；IKN電動組織勻漿機，上海依肯機械設(shè)備有限公司；冷凍離心機，美國貝克曼公司；Spectra Max M5多功能酶標儀，美國Molecular Devices公司。

1.2 方法

1.2.1動物分組

所有小鼠隨機分為6組，每組10只，分別為正常對照組，模型組，利肝康片組和復(fù)方利肝湯高、中、低劑量組。

1.2.2 急性肝損傷模型建立及給藥

正常對照組：灌胃相同體積的生理鹽水，每日1次，連續(xù)7日；模型組：灌胃相同體積的生理鹽水，每日1次，連續(xù)7日；利肝康片組：按0.5g/kg混懸液灌胃，每日1次，連續(xù)7日；復(fù)方利肝湯組：分別按20g/kg、10g/kg、5g/kg混懸液灌胃，每日1次，連續(xù)7日。模型組、利肝康片組以及復(fù)方利肝湯組于第7日末次給藥3h后腹腔注射CCl4，20mg/Kg，橄欖油稀釋。各組均禁食不禁水，16h后，眼眶取血，同時脫頸椎處死小鼠，迅速取出肝臟，存放于-70℃，備用。

1.2.3 指標檢測

取小鼠眼眶血，靜置15min后，4000rpm，離心20min，分離血清，置于-70℃保存?zhèn)溆?。取小鼠右葉肝組織加適量生理鹽水，制備成勻漿，-70℃保存?zhèn)溆谩Ｑ錋LT，AST，LDH及肝組織MDA和T-AOC的含量測定，嚴格按試劑盒說明書操作。

1.2.4 肝臟病理學(xué)檢查

取肝左葉組織距邊緣0.5cm處小塊組織，用10%甲醛溶液固定，72h后取出，按常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片后，HE染色、脫水、透明、封片，光學(xué)顯微鏡（400倍放大）下觀察肝病理學(xué)變化。肝損害程度判斷標準用“+”表示輕度肝損害，肝小葉內(nèi)肝細胞脂肪變性，偶見點狀壞死，少見匯管區(qū)炎癥，肝損害面積在1/3以內(nèi)；用“++”表示中度肝損害，肝細胞脂肪變性壞死明顯，炎癥細胞浸潤明顯，可見中央靜脈區(qū)淤血，肝損害面積在1/3～2/3之間；用“+++”表示重度肝損害，肝細胞彌漫性脂肪變性，點狀壞死多見或可見大片肝細胞壞死，中央靜脈區(qū)淤血嚴重，肝損害面積大于2/3。為便于統(tǒng)計分析“-”計為0，“+”計為1分，“++”計為2分，“+++”計為3分，進行量化評分。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)處理？

生化指標值以x±s表示，差異顯著性分析用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析處理，p<0.05是差異顯著性標準。

2 實驗結(jié)果

2.1 血清ALT、AST、LDH的活性測定結(jié)果

血清指標檢測結(jié)果如表1所示，模型組與正常對照組比較，血清中ALT、AST、ALP和LDH分別升高3.9，3.4，2.1，1.6倍（P<0.05），表明造模型成功。而給予不同劑量的復(fù)方利肝湯后，ALT、AST、ALP和LDH各項指標與模型組均有顯著降低，其中高劑量組分別下降66.2%，62.1%，40.9%，38.1%，具有顯著性差異（P<0.05），且優(yōu)于利肝康片組，說明復(fù)方利肝湯能減少肝細胞內(nèi)酶的逸出，對肝細胞有較明顯的保護作用。

2.2 肝組織MDA、T-AOC的活性檢測結(jié)果

實驗結(jié)果如表2，模型組的肝組織中MDA的含量升高至對照組的2.6倍，而給予復(fù)方利肝湯7d后，與模型組對比，肝組織中MDA的含量顯著降低，恢復(fù)至對照組的正常水平。這表明復(fù)方利肝湯明顯抑制了CCl4誘導(dǎo)的脂類過氧化反應(yīng)。此外，模型組肝臟T-AOC經(jīng)CCl4損傷后降低至對照組的45%（P<0.05），而復(fù)方利肝湯組肝臟T-AOC是模型組的1.4倍（P<0.05），且高于對照組。這提示復(fù)方利肝湯可明顯恢復(fù)CCl4致肝臟總抗氧化能力損傷，并可一定程度提高小鼠肝臟總抗氧化能力。

3 討論

人們習(xí)慣將CCl4致肝損傷模型作為篩選具有保肝降酶作用藥物的常用模型之一。CCl4進入體內(nèi)后，經(jīng)肝細胞色素P450酶激活，生成三氯甲基自由基（CCl3），通過氫吸附而攻擊內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的磷脂分子，引起膜的脂質(zhì)過氧化，其產(chǎn)物對細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能造成不可逆轉(zhuǎn)的改變；CCl4繼而與膜脂質(zhì)和蛋白質(zhì)大分子共價結(jié)合， 破壞細胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性；CCl4還可以抑制細胞膜和微粒體膜上鈣泵的活性，使Ca2+內(nèi)流增加，從而引起細胞中毒死亡[1]。許多研究發(fā)現(xiàn)，中藥材所含由的很多天然化合物能夠通過抑制異源性化學(xué)物質(zhì)激活的代謝酶的活性或者抗氧化功能，保護化學(xué)性肝損傷[2，3]。因而，研究并開發(fā)具有保肝解毒功效的中藥制劑具有非常重要臨床意義和治療價值。

現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，多種中草藥對肝損傷有良好的保護作用。張銀娣等[4]實驗證實黃芪對CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷有很好的保護作用，能顯著抑制CCl4引起的小鼠AST、ALT活性升高，降低肝組織中MDA含量，增加GSH含量。并研究證明其主要藥效成分為黃芪皂苷。汪暉等[5]證明阿魏酸鈉對肝GSH含量無明顯影響，但可明顯減少外源化學(xué)物質(zhì)引起的GSH耗竭，抑制MDA含量的增加，改善肝組織形態(tài)學(xué)病變。 郝乘儀等[6]研究發(fā)現(xiàn)刺五加可增加機體免疫力，對肝臟有較好的保護作用，其主要有效成分刺五加酸可顯著降低血清AST、ALT含量，減少肝組織中MDA含量及GSH的消耗，具有防止他克林誘導(dǎo)的肝損傷作用。

本研究表明，提前給予復(fù)方利肝湯，可顯著降低肝損傷小鼠血清中AST和ALT酶活性，降低肝組織中MDA含量，提高肝臟總抗氧化能力，有效改善肝臟損傷病理形態(tài)學(xué)癥狀，從而能夠有效保護CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷。其作用機制可能是選擇性地提高肝細胞滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中細胞色素P450的濃度，并使谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性增加，提高肝細胞解毒能力[7]；增強過氧化物岐化酶（SOD）和GSH–P的活性，顯著抑制肝臟脂質(zhì)過氧化反應(yīng)；改善組織細胞的代謝功能，增加排泄和促進肝臟血流循環(huán)動態(tài)等。

參考文獻：

[1] Recknagel RO， Glende EA， Dohk JA，et al. Mechanisms of carbon tetrachloride Toxicity [J]. Pharmacol Ther， 1989， 43（1）： 139-142.

[2] Ilavarasan R， Vasudevan M， Anbazhagan S， et a1. Antioxidant activity of Thespesia populnea bark extracts against carbon tetrachloride-induced liver injury in Rats [J]. J Ethnopharmacol， 2003， 87：227～230.

[3] Lee KJ， Jeong HG. Protective efects of Platycodi radix on carbon tetrachloride-induced hepatotoxicity [J]. Food Chem Toxicol， 2002， 40： 517～525.

[4] 張銀娣，沈建平，等.黃芪皂苷抗實驗性肝損傷作用[J].藥學(xué)學(xué)報，1992，27 （6）：401-406.

[5] 汪暉，等.阿魏酸鈉減輕醋氨酚致小鼠肝損傷[J].中國藥理學(xué)報，1994，13 （1）：81-83.

[6] 郝乘儀， 吳艷玲， 廉麗花， 等. 刺五加酸對急性肝損傷小鼠的保護作用[J]. 醫(yī)藥導(dǎo)報， 2014， 9（33）： 1126-1128.

[7] 武謙虎.常用治療肝病中藥[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2001.