益生菌混合培養富集鋅條件優化研究

劉冬　黃守敏　畢璋友等

摘要 [目的]優化益生菌混合培養富集鋅的條件。[方法]以青春雙歧桿菌ys01、德氏乳桿菌保加利亞亞種1.148 0和嗜酸乳桿菌ysh2混合培養富鋅。通過單因素試驗和中心組合試驗對富鋅條件進行優化。[結果]最佳富鋅培養條件為：低聚果糖10 g/L、Zn2+ 0.41 mg/ml、蛋白胨12.2 g/L、初始pH 6.0、接種比例3∶2∶1、接種量4.6%、培養時間72 h。在該條件下，青春雙歧桿菌ys01、德氏乳桿菌保加利亞亞種1.148 0和嗜酸乳桿菌ysh2混合菌體鋅的含量為550 μg/g。[結論]以試驗所得富鋅混合菌體制備的富鋅酸奶發酵劑具有良好的發酵性能。

關鍵詞 富集鋅；混合培養；益生菌

中圖分類號 S509.9；TS252.54 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）20-259-04

Abstract [Objective] To optimize zincriching conditions by probiotics in the form of mixing culture.[Method] Bifidobacterium adolescentis ys01，Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus 1.148 0，and Lactobacillus acidophilus ys2 in the form of mixed culture were used to enrich zinc （Zn）.The zinc enrichment conditions were optimized by singlefactor and Central Composity design experiments.[Result] The optimal conditions were fructooligosaccharide 10 g/L，Zn2+ 0.41 mg/ml，peptone 12.2 g/L，initial pH 6.0，the inoculation proportion 3∶2∶1，inoculation amount 4.6% and culture time 72 h.In these conditions，the mass of zinc in the mixed cells of Bifidobacterium adolescentis ys01， Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus 1.148 0，and Lactobacillus acidophilus ys2 was 550 μg/g.[Conclusion] The zinc enrichment yogurt starter，which were prepared by the mixed cells，had good fermentation performance.

Key words Zinc enrichment； Mixed cultivation； Probiotics

鋅是人體必需的微量元素之一，參與核酸、蛋白質的合成，具有促進生長發育，提高免疫力和促進食欲等功能[1-2]。補鋅產品分為無機鋅和有機鋅，無機鋅吸收利用率低，且會刺激胃腸黏膜，引起惡心嘔吐等癥狀 [3] ，而有機鋅較其具有吸收利用率高、副作用小等優點。有機鋅分為絡合鋅、螯合鋅、蛋白質鋅鹽和多糖鋅復合體等幾種[1]，以食用菌、酵母菌和鼠李糖乳桿菌單獨培養富鋅可提高菌體中的含鋅量[3-5]。研究人員進行動物試驗發現，該富鋅菌體可以提高犬血液中鋅含量及機體抗氧化能力，并能調節腸道菌群和改善腸道內環境[4]。而以乳酸菌混合培養富鋅并制備富鋅酸奶發酵劑卻鮮見報道。筆者以青春雙歧桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜酸乳桿菌混合培養富鋅，利用富鋅混合菌體制備富鋅酸奶發酵劑，同時考察其發酵性能。

1 材料與方法

1.1 材料

嗜熱鏈球菌ys14（Streptococcus thermophilus ys14）、德氏乳桿菌保加利亞亞種1.1480（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus 1.1480）、青春雙歧桿菌ys01（Bifidobacterium adolescentis ys01）、嗜酸乳桿菌ysh2（Lactobacillus acidophilus ys2）、干酪乳桿菌ys05（Lactobacillus casei ys05）由合肥工業大學微生物實驗室保藏提供；酸奶發酵劑Ⅰ（由嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌組成）和酸奶發酵劑Ⅱ（由保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌和干酪乳桿菌組成）購自北京川秀科技有限公司。雀巢全脂奶粉、光明脫脂奶粉和白砂糖購自家樂福超市；氫氧化鈉、二硫腙、四氯化碳等均為分析純；蛋白胨、大豆胨、牛肉浸粉、Tween80等為生化試劑。

主要儀器：pHS3C型pH儀，上海精密科學儀器有限公司；702SM自動電位滴定儀，廣東深圳瑞士Metrohm萬通；NDJ7型黏度計，廈門中村光學儀器廠；MCO18AIC CO2培養箱，上海旦鼎國際貿易有限公司；FD1B50冷凍干燥機，北京博醫康實驗儀器有限公司；KXX512馬弗爐，上海索域試驗設備有限公司； AR1140分析天平，奧豪斯國際貿易有限公司；MWCO 3500透析袋。

1.2 方法

1.2.1 單因素試驗。在37 ℃下，對青春雙歧桿菌ys01、德氏乳桿菌保加利亞亞種1.148 0和嗜酸乳桿菌ysh2混合培養富鋅條件進行單因素試驗，觀察Zn2+濃度（1、3、5 mg/ml）、接種比例（青春雙歧桿菌ys01：德氏乳桿菌保加利亞亞種1.148 0∶嗜酸乳桿菌ysh2為1∶1∶1、2∶2∶1、3∶3∶1、3∶2∶1、2∶1∶1）、接種量（體積分數2%、4%、6%）、低聚糖及其濃度（分別以0、5、10、15、20 g/L的低聚果糖、低聚木糖、低聚異麥芽糖和大豆低聚糖代替液體改良MRS培養基中等量葡萄糖）、氮源及其濃度（在改良MRS液態培養基中分別添加0、1、3、5、7 g/L的蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、檸檬酸氫二銨和硫酸銨）、初始pH（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）和培養時間（36、48、60、72、84 h）對菌體含鋅量的影響。

1.2.2 中心組合試驗。依據單因素試驗結果，選擇Zn2+、蛋白胨和接種量進行中心組合試驗，并進行驗證試驗。試驗設3個重復取其平均值。用Design Expert 7.0軟件對中心組合試驗結果處理，采用F檢驗對數據進行方差分析。

1.2.3 菌體含鋅量的測定。參考SánchezSegarra等報道方法對菌體進行處理[6]，然后參考GB/T 5009.142003[7]以二硫腙比色法測定菌體含鋅量。

1.2.4 乳酸菌活菌數的測定。乳酸菌活菌數的測定參考Ye等報道的方法[8]進行培養計數。

1.2.5 液態和固態富鋅酸奶發酵劑的制備。將青春雙歧桿菌ys01、德氏乳桿菌保加利亞亞種1.148 0和嗜酸乳桿菌ysh2混合富鋅培養物置于50 ml無菌離心管中，在4 ℃，10 000 r/min條件下冷凍離心10 min，用一定體積的脫脂復原乳（108 ℃滅菌10 min）將混合菌體洗下并調整至適宜濃度（約3×108cfu/ ml）即得液態富鋅酸奶發酵劑。將液態富鋅酸奶發酵劑置于低溫冰箱（-80 ℃）預凍2 h，取出置于真空冷凍干燥機中干燥，冷凍溫度-50 ℃，真空度20 Pa，干燥時間約48 h，得固態富鋅酸奶發酵劑。

1.2.6 富鋅酸奶發酵性能測定。將上述固態富鋅發酵劑按2 g/L的接種量接于全脂乳培養基（市售酸奶發酵劑Ⅰ和Ⅱ為對照1和2）中，42 ℃發酵一定時間，于4 ℃冰箱中冷藏12 h，其發酵性能的測定參考劉冬等報道的方法[9]，試驗重復3次，其結果以“平均值±標準偏差”表示。

2 結果與分析

2.1 菌株和Zn2+濃度對菌體含鋅量的影響

由圖1可見，在青春雙歧桿菌ys01、嗜酸乳桿菌ysh2、德氏乳桿菌保加利亞亞種1.148 0、嗜熱鏈球菌ys14和干酪乳桿菌ys05 5株菌中，前3株具有較好的富鋅效果，選擇它們進行混合培養富鋅。此外，Zn2+濃度在0.1～0.3 mg/L范圍內隨Zn2+濃度增加，菌株ys01、1.148 0和ysh2菌體含鋅量也增加，然而在0.3～0.5 mg/L范圍內，菌株ys01和1.148 0菌體含鋅量略有下降，而嗜酸乳桿菌ysh2菌體含鋅量基本沒有變化，因此，選擇0.3 mg/L的Zn2+濃度進行以下試驗。

2.2 不同接種比例和接種量對菌體含鋅量的影響

選擇青春雙歧桿菌ys01、德氏乳桿菌保加利亞亞種1.148 0和嗜酸乳桿菌ysh2進行混合培養富鋅，結果如圖2所示。在2%～6%范圍內，青春雙歧桿菌ys01、德氏乳桿菌保加利亞亞種1.148 0和嗜酸乳桿菌ysh2的接種比例為3∶2∶1時菌體含鋅量分別為228、232和229.5 μg/g，在相同接種量下均高于其他接種比（1∶1∶1、2∶2∶1、3∶3∶1和2∶2∶1）。在3∶2∶1接種比下，接種量在2%～4%范圍內，菌體含鋅量緩慢增加，而接種量在4%～6%范圍內，菌體含鋅量略有下降，即適宜的接種量為4%。

2.3 低聚糖及其添加量對菌體含鋅量的影響

由圖3可見，與對照相比，5～15 g/L的低聚糖能不同程度地提高菌體含鋅量，可能是低聚糖促進青春雙歧桿菌ys01、嗜酸乳桿菌ysh2和德氏乳桿菌保加利亞亞種1.148 0的生長[10]從而促進它們富鋅。其中，以10 g/L的低聚果糖效果最好。

2.4 氮源及其添加量對菌體含鋅量的影響

如圖4所示，添加1～7 g/L的硫酸銨和檸檬酸氫二銨對菌體含鋅量無顯著影響，而蛋白胨、牛肉膏和酵母膏能不同程度地提高菌體中鋅的含量，其中以蛋白胨的效果最好。在1～3 g/L范圍內，隨蛋白胨濃度的增加菌體中鋅的含量也隨之增加，而在3～7 g/L范圍內，菌體中鋅含量隨蛋白胨濃度的增加而下降，即適宜的蛋白胨濃度為3 g/L。

2.5 初始pH和培養時間對菌體含鋅量的影響

如圖5所示，初始pH在5.0～6.0范圍內，菌體含鋅量隨初始pH的增加呈增加趨勢，之后菌體含鋅量快速下降，即適宜的初始pH為6.0。培養時間對菌體含鋅量影響的變化趨勢與初始pH類似。當培養時間為72 h時，菌體含鋅量最大值為342.3 μg/g。

2.6 中心組合試驗

依據單因素試驗結果，選擇Zn2+、蛋白胨和接種量按表1進行中心組合試驗，結果如表2所示，結果利用Designexpert 7.0對試驗數據進行分析處理。

試驗得出，對菌體含鋅量的影響程度從小到大依次為蛋白胨、接種量和Zn2+，回歸方程為：Y=552.35+23.85A+8.31B+18.63C-0.5AB-49.75AC-8.75BC-75.04A2-49.94B2-59.84C2。

由方差分析可知，接種量和Zn2+濃度交互項對菌體含鋅量有顯著影響（PAC<0.01），而蛋白胨同Zn2+濃度和接種量的交互項對菌體含鋅量均無顯著影響。

根據上述回歸方程任選其中兩因素為變量，另一因素位于中心點作圖6、7和8。如圖6和7所示，方程存在最大值點。由方程計算得到菌體最高含鋅量為555.1 μg/g，此時Zn2+濃度、蛋白胨濃度和接種量分別為0.41 mg/ml、12.2 g/L和4.6%。在上述最佳條件下進行驗證試驗，青春雙歧桿菌ys01、德氏乳桿菌保加利亞亞種1.148 0和嗜酸乳桿菌ysh2混合菌體中鋅的含量為550 μg/g，與預測值基本一致。

2.7 富鋅酸奶發酵劑及其發酵性能

冷凍干燥后的富鋅酸奶發酵劑為淺黃色粉末，其主要發酵性能見表3。凝乳時間為7.0 h，以其發酵制作的發酵乳酸度、pH、黏度和活菌數分別為89°T、4.3、126 mPa·s和3.7×108cfu/ ml，與市售酸奶發酵劑（對照1和2）相比，富鋅酸奶發酵劑產酸能力較強，而黏度、凝乳時間和活菌數與對照相當，表明富鋅酸奶發酵劑具有良好的發酵性能。