琯溪蜜柚CmPME1的克隆及其在果實發育過程中的表達分析

劉志發 潘騰飛 潘東明

摘 要 利用RT-PCR技術從‘琯溪蜜柚中克隆得到1條PME（pectinmethylesterase）基因的ORF序列，命名為CmPME1。該序列編碼一個含有582個氨基酸的蛋白質，分子量63.37 ku，該蛋白屬于穩定的堿性親水性蛋白。同源性分析表明：其編碼的氨基酸序列與可可樹（Theobroma cacao）、毛果楊（Populus trichocarpa）的同源性分別為76%、74%，與甜橙的氨基酸序列同源性高達99%。實時熒光定量PCR結果表明，隨著果實的發育，CmPME1的表達量逐漸升高，在花后170 d達到最高，然后逐漸降低，遠中柱汁胞CmPME1的表達量高于近中柱。

關鍵詞 琯溪蜜柚；PME；克隆；實時熒光定量PCR

中圖分類號 S813.3 文獻標識碼 A

琯溪蜜柚[Citrus maxima（Burm.） Merr.]果實存在汁胞粒化的生理病害， 表現為汁胞中柱和軸端汁胞異常膨大， 汁胞變硬、細胞壁加厚、木質纖維化、出汁率下降， 風味變淡。琯溪蜜柚果實汁胞粒化通常從囊瓣近蒂端汁胞發生， 后漸向果心發展， 其中以果心處長形汁胞粒化最為嚴重[1-3]。據觀察，琯溪蜜柚果實汁胞粒化發生在果實生長后期（一般為9月中下旬開始），采后貯藏期間果實汁胞粒化進一步加重[2]。有報道指出果膠甲酯酶與柑橘果實的粒化有關[4-5]。

果膠甲酯酶（pectinmethylesterase，簡稱PME、PE， EC： 3. 1. 1. 11）廣泛存在于植物以及一些細胞壁降解的微生物中[6]。果膠甲酯酶能水解果膠生成果膠酸、甲醇、氫離子，進而導致果膠酸鈣的形成[7-9]。PME屬于多基因家族，由于PME結構和表達模式的多樣性，其作用也存在差異[10-11]。植物中果膠甲酯酶在細胞壁降解[12-13]，小孢子發生和花粉管發育[14-16]，種子萌發[17]，根尖延伸[18]，果實的軟化成熟[19]等方面起著重要作用。近幾年來，在植物中有關PME基因的克隆與表達已有許多報道，已從草莓、煙草、白菜等植物中克隆得到果膠甲酯酶基因[20-22]，認為該基因與果實衰老過程中結構變化、植物病毒之間存在相互作用、雄性不育等功能有關。此外，在柑橘汁胞和柑橘皮中也克隆得到了PME基因[23-24]。

為從探明‘琯溪蜜柚CmPME1在果實生長過程中表達水平變化與果實粒化的關系，本研究利用RT-PCR技術從‘琯溪蜜柚汁胞中克隆得到CmPME1的ORF序列，并對其進行了生物信息學分析，采用實時熒光定量PCR技術檢測‘琯溪蜜柚果實發育不同時期和不同部位的CmPME1的表達特性。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗所用材料采自漳州市平和縣小溪鎮果園。采集時間為2013年7月16日至10月28日，約每隔10 d采集1次樣品。取汁胞凍于液氮中，存放于-80 ℃。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取、檢測及cDNA第一鏈的合成

柚汁胞總RNA提取參照鐘鳳林等[25]的Trizol方法提取，紫外分光光度計測定RNA的純度和濃度。按照Trans ScriptⅡFirst-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒合成cDNA第一條鏈。

1.2.2 CmPME1基因ORF的克隆 采用Primer 5.0軟件設計引物。根據甜橙基因組中PME中的cDNA序列，在起始密碼子和終止密碼子位置設計引物（見表1），引物合成與測序均委托上海博尚生物技術有限公司完成。

以琯溪蜜柚汁胞cDNA為模板，進行PCR擴增。反應體系為25 μL，其中10×Ex-TaqBuffer 2.5 μL，dNTPs（10 mmol）0.5 μL，上下游引物（10 μmol）各0.5 μL，模板cDNA1 μL，Ex-Taq（5 U/μL）0.15 μL，加水至終體積25 μL。反應程序為：94 ℃預變性4 min；94 ℃ 45 s，58 ℃ 50 s，72 ℃ 2 min，35個循環；最后72 ℃再延伸10 min。PCR反應結束后電泳檢測，將目的片段回收、連接、轉化、測序。

1.2.3 CmPME1的熒光定量表達 實時熒光定量PCR引物的設計與合成：以‘琯溪蜜柚Tubulin基因為內參基因，根據已克隆的CmPME1基因的ORF序列，按照標準熒光定量PCR引物原則設計引物（表2）。

用試劑盒的方法分別提取‘琯溪蜜柚果實發育不同時期和不同部位汁胞的總RNA，每個樣品進行3次生物重復，并以它們為模板，按照PrimeScript RT reagent kit（Perfect Real Time）試劑盒的方法合成cDNA第一鏈，-20 ℃保存備用。

熒光定量PCR在羅氏LightCycler 480熒光定量PCR儀上進行。將合成的cDNA（500 ng/μL）稀釋10倍作為模板，進行熒光定量PCR。反應體系為20 μL：2×SYBR PremixEx TaqⅡ10 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，cDNA模板1 μL，加ddH2O至終體積20 μL，每個樣品進行3次技術重復。PCR反應程序采用兩步法：95 ℃ 30 s（預變性過程）；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環（PCR反應過程）；95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min（熔解曲線分析過程）。根據熒光定量PCR目的基因CmPME1和內參基因β-Tubulin的Ct值，利用2-ΔΔCT（Livak）方法對果實發育不同時期和不同部位汁胞的CmPME1基因進行相對定量計算。

1.2.4 序列分析與生物信息學分析 采用ExPASy ProtParam（http：//www.expasy.org/tools/protparam.html）進行蛋白質理化性質的分析；采用Tmpered（http：//www.ch.embnet.org/software/tepred-form.html）進行跨膜結構預測與分析；采用PSORT（http：//psort.nibb.ac.jp/）進行亞細胞定位預測與分析；利用Mega 5.22進行系統進化樹分析。

2 結果與分析

2.1 CmPME1 ORF序列的獲得與CmPME1系統進化分析

CmPME1所擴增的ORF片段大小為1 748 bp（圖1），經DNAMAN軟件分析CmPME1編碼582個氨基酸，ATG為起始密碼子，TAA為終止密碼子（圖2）。經Blast比對發現，該氨基酸序列與陸地棉（Gossypium hirsutum）、可可樹（Theobroma cacao）、毛果楊（Populus trichocarpa）和擬南芥（Arabidopsis thaliana）的氨基酸序列的同源性分別達77%、76%、74%和71%，與甜橙（Citrus sinensis）的氨基酸序列同源性為99%。利用Mega 5.22近鄰相接法（Neighbor-Joining，NJ）對CmPME1與來自12種不同物種的PME蛋白進行系統進化分析（圖3）。從圖3可以看出，12種不同植物的PME蛋白聚成一類，CmPME1和同屬于柑橘屬的甜橙的PME蛋白親緣關系最近。

2.2 CmPME1編碼蛋白理化性質和亞細胞定位預測分析

通過ProtParam軟件對CmPME1蛋白進行基本的理化分析可知，相對分子量為63.37 ku，分子式為C2 784H4 428N796O851S22。該蛋白由20種氨基酸殘基組成，其中丙氨酸（Ala）、絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）的含量較豐富，比例分別為9.8%、8.2%、7.9%；該蛋白含54個帶負電的氨基酸（Asp+Glu）和66個帶正電的氨基酸（Arg+Lys）， 總平均疏水指數-0.251，其理論等電點為9.16，不穩定指數為29.74，說明該蛋白屬于穩定的堿性親水性蛋白。

利用程序wolf psort分別對‘琯溪蜜柚CmPME1蛋白的亞細胞定位進行分析，CmPME1蛋白在線粒體內膜的分值最高，推測該蛋白定位在線粒體內膜。

2.3 CmPME1在果實發育不同時期和不同部位的表達

CmPME1在果實發育不同時期和不同部位的熒光定量表達如圖4。從圖中可以看出，隨著時間的增加，CmPME1的表達量呈現先逐漸升高后逐漸降低趨勢，在花后170 d表達量達到最高，遠中柱汁胞CmPME1的表達量高于近中柱。

3 討論與結論

目前，PME已經在很多植物中被克隆和研究，但在柚中未見報道。本研究克隆得到1條PME的ORF序列。系統進化樹分析結果表明，CmPME1與其它植物的PME有較高的同源性。CmPME1氨基酸序列與甜橙親緣關系最近，同源性高達99%。

大部分種類的果實中PME活性都隨果實的成熟程度增強，使果膠、纖維素等細胞壁物質發生降解，從而導致果肉的軟化[26-27]。熒光定量PCR結果表明，‘琯溪蜜柚果實的成熟過程中，CmPME1的表達量逐漸升高。可能與果實成熟過程中，果實變軟有關。‘琯溪蜜柚果實汁胞粒化發生在果實生長后期，本研究CmPME1在花后170 d表達量最高，遠中柱汁胞CmPME1的表達量高于近中柱。可能是由于柚果實汁胞在花后170 d左右開始發生粒化，粒化過程中CmPME1基因的表達量逐漸降低。Singh等[28]報道，粒化與果膠甲酯酶的活性呈負相關，粒化程度高的Kaula寬皮柑橘的果膠甲脂酶活性最低。而‘琯溪蜜柚果實汁胞粒化通常從囊瓣近蒂端汁胞發生，后漸向果心發展。Chakrawar等[29]也報道粒化果實的果膠甲酯酶活性比正常的低，并認為果膠甲酯酶與粒化有關。可見，近中柱CmPME1的表達量較遠中柱低，可能是因為近中柱最易發生粒化，表達量較低。佘文琴等[30]研究了‘琯溪蜜柚果實發育過程中PME酶活性，發現其活性在9月28日達到最高，之后下降，這與CmPME1的表達量的變化趨勢有一定相似性。但是否因粒化導致CmPME1的表達量下降還待進一步研究。

參考文獻

[1] Daulta B S， Arora R K. Studies on granulation in different cultivars of sweet orange（C. sinensis Osbeck）[J]. Haryana Journal of Horticultural Sciences， 1990， 19（1-2）： 18-21.

[2] 潘東明， 鄭國華， 陳桂信， 等. 琯溪蜜柚汁胞粒化原因分析[J]. 果樹學報， 1999， 16（3）： 202-209.

[3] 張振玨， 謝志南， 許文寶. 琯溪蜜柚汁囊分化和粒化過程的解剖學觀察[J]. 植物學報， 1999， 41（6）： 16-19.

[4] Chakrawar V R， Singh R J. Studies on citrus granulation II Physiological and biochemical aspects of granulation[J]. Haryana J Hort Sci， 1977， 6（3/4）： 132-135.

[5] Prasanna V， Prabha T N， Tharanathan R N. Fruit ripening phenomena-an overview[J]. Critical reviews in food science and nutrition， 2007， 47（1）： 1-19.

[6] Ly-Nguyen B， Van Loey A M， Fachin D， et al. Partial purification， characterization， and thermal and high-pressure inactivation of pectin methylesterase from carrots（Daucus carrota L.）[J]. Journal of agricultural and food chemistry， 2002， 50（19）： 5 437-5 444.

[7] Alonso J， Rodriguez T， Canet W. Effect of calcium pretreatments on the texture of frozen cherries. Role of pectinesterase in the changes in the pectic materials[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 1995， 43（4）： 1 011-1 016.

[8] Alonso J， Canet W， Rodriguez T. Thermal and calcium pretreatment affects texture， pectinesterase and pectic substances of frozen sweet cherries[J]. Journal of food science， 1997， 62（3）： 511-515.

[9] Willats W G T， McCartney L， Mackie W， et al. Pectin： cell biology and prospects for functional analysis[J]. Plant Mol Biol， 2001 ， 47（1-2）： 9-27.

[10] Markovic O， Janecek S. Pectin degrading glycoside hydrolases of family 28： sequence-structural features， specificities and evolution[J]. Protein Engineering， 2001， 14（9）： 615-631.

[11] Pelloux J， Rusterucci C， Mellerowicz E J. New insights into pectin methylesterase structure and function[J]. Trends in plant science， 2007， 12（6）： 267-277.

[12] Al-Qsous S， Carpentier E， Klein-Eude D， et al. Identification and isolation of a pectin methylesterase isoform that could be involved in flax cell wall stiffening[J]. Planta， 2004， 219（2）： 369-378.

[13] Micheli F. Pectin methylesterases： cell wall enzymes with important roles in plant physiology[J]. Trends in plant science， 2001， 6（90）： 414-419.

[14] Rogers H J， Bate N， Combe J， et al. Functional analysis of cis-regulatory elements within the promoter of the tobacco late pollen gene g10[J]. Plant molecular biology， 2001， 45（5）： 577-585.

[15] Tian G W， Chen M H， Zaltsman A， et al. Pollen-specific pectin methylesterase involved in pollen tube growth[J]. Developmental biology， 2006， 294（1）： 83-91.

[16] Bosch M， Cheung A Y， Hepler P K. Pectin methylesterase， a regulator of pollen tube growth[J]. Plant Physiology， 2005， 138（3）： 1 334-1 346.

[17] Ren C， Kermode A R. An increase in pectin methyl esterase activity accompanies dormancy breakage and germination of yellow cedar seeds[J]. Plant Physiology， 2000， 124（1）： 231-242.

[18] Pilling J， Willmitzer L， Bücking H， et al. Inhibition of a ubiquitously expressed pectin methyl esterase in Solanum tuberosum L. affects plant growth， leaf growth polarity， and ion partitioning[J]. Planta， 2004， 219（1）： 32-40.

[19] Singh R， Sing R J. Pectinesterase activity in relation to granulation in citrus fruits[J]. Sci Cult， 1985（51）： 315-316.

[20] Castillejo C， de la Fuente J I， Iannetta P， et al. Pectinesterase gene family in strawberry fruit： study of FaPE1， a ripening‐specific isoform[J]. Journal of Experimental Botany， 2004， 55（398）： 909-918.

[21] 李春波， 高 鋒， 鐘永旺， 等. 煙草果膠甲基酯酶（PME）基因的克隆及功能分析[J]. 生物化學與生物物理進展， 2004， 31（7）： 643-649.

[22] 劉志勇， 李承彧， 葉雪凌， 等. 大白菜果膠甲酯酶基因BrPME1的克隆及特征分析[J]. 中國農業科學， 2011， 44（2）： 325-334.

[23] Joseph Nairn C， Lewandowski D J， Burns J K. Genetics and expression of two pectinesterase genes in Valencia orange[J]. Physiologia Plantarum， 1998， 102（2）： 226-235.

[24] 葉 華， 馬 力. RT-PCR法克隆柑橘皮果膠酯酶基因[J]. 包裝與食品機械， 2011， 29（3）： 6-8.

[25] 鐘鳳林， 郭志雄， 馬傳營， 等. 琯溪蜜柚汁胞RNA提取方法的比較[J]. 生物技術通報， 2010（2）： 109-112.

[26] Brummell D A， Da lcin v， Carlos H Crisosto， et al. Cell wall metabolism during maturation， ripening senescence of peach fruit[J]. Journal of Experimental Botany， 2004， 55（405）： 2 029-2 099.

[27] Giovannoni J. Molecular biology of fruit maturation and ripening[J]. Annual review of plant biology， 2001， 52（1）： 725-749.

[28] Singh R， Sing R J. Pectinesterase activity in relation to granulation in citrus fruits[J]. Sci Cult， 1985（51）： 315-316.

[29] Chakrawar V R， Singh R J. Studies on citrus granulation II physiological and biochemical aspects of granulation[J]. Haryana J Hort Sci， 1977， 6（3-4）： 132-135.

[30] 佘文琴， 趙曉玲， 潘東明， 等. 細胞壁代謝與琯溪蜜柚果實成熟過程汁胞粒化的關系[J].熱帶亞熱帶植物學報， 2008， 16（6）： 545-550.