P16基因抑制胃癌細胞轉移的機制初步研究

朱崎 歐瑜 李杰通

摘要：目的： 將p16重組質粒轉染人高轉移胃癌細胞株MKN-28中，觀察轉染前以及轉染后p16基因對胃癌細胞侵襲轉移能力與運動能力的影響。在基因的水平探討p16基因對于胃癌細胞轉移的抑制機制。方法： 通過脂質體傳染法順利的將p16重組質粒轉染到MKN-28細胞株中，根據Transwell小室測定法測定細胞穿膜侵襲的能力，利用SDS-PAM凝膠電泳法檢測明膠酶的活性。結果： 在經過p16重組質粒轉染后，根據顯微鏡下的計數顯示，胃癌細胞能夠穿透基底膜的數量與轉染前相比具有明顯的減少（p<0.05），具有統計學意義。細胞的運動能力也是差與轉染前。PAM凝膠電泳顯示負染帶的寬度有明顯的變窄，降解基質膜的轉移能力明顯下降。結論： p16基因抑制胃癌細胞的轉移可能是通過對癌細胞的侵襲和運動能力的控制得以實現的。

關鍵詞：p16基因；胃癌細胞；癌細胞轉移

資助項目：湖南省教育廳科技計劃項目（13C963）

胃癌是一種常見的消化系統惡性腫瘤，它嚴重危害著人們的身心健康，在全球腫瘤發病率以及死亡率中位居第2，給胃癌患者帶來了很大的身體危害及心理壓力[1]。并且目前胃癌的發病率在國內外均呈顯著上升的趨勢。臨床醫學上對于胃癌的治療也是較為吸引人們的注目，目前利用腫瘤抑制基因對癌細胞的轉移進行抑制成為研究的熱點[2]。故本次研究利用p16轉染人高轉移胃癌細胞株MKN-28，研究轉染前后p16基因對于胃癌細胞轉移以及運動的能力的影響，旨在尋求一種能夠為以后利用該基因進行癌癥治療的時候提供實驗以及理論上的依據。

注：P值表示MKN-28與P16- MKN-28組間比較的結果。

1材料與方法

1.1主要試劑

P16重組質粒由本室進行構建，脂質體買自Invitrogen公司，RT-PCR試劑盒買自TaKaRa公司，RPMI1640培養基為Hyclone產品。G418及丙烯酰胺凝膠電泳試劑買自Sigma公司，Transwell細胞培養小室為Costor產品，纖維黏連蛋白和ECL試劑盒購自Invitrogen公司。

1.2細胞培養與處理

胃癌細胞株MKN-28接種于RPMI1640培養基，在37℃、含有50ml/LCO2 的濕潤空氣的恒溫密閉式培養箱中進行培養。按照1×105/孔的細胞密度進行接種，并使用無血清培養液進行清洗。將脂質體稀釋與無血清培養液中制備成混合溶液A。另將p16以及空白質粒稀釋成B1和B2。然后將A與B溶液分別進行混合，并置室溫放置20分鐘。然后滴加混合液和無血清培養液，培養一定時間之后，換為G418完全培養液，然后篩選，擴大培養。設轉染前胃癌細胞為空白對照組，而轉染后為陰性對照組。

1.3細胞運動能力的測定

將實驗用品先進行預冷處理，在室膜表面加入膠體，此時要注意涂抹要均勻，然后對著燈光輕輕拍打均勻。然后將其放在培養液中水化，然后在外膜上涂上纖維黏連蛋白，干燥。最后一定濃度的細胞放置于Transwell小室中進行培養，培養時間為10-60h，每10h小時為觀察點。具體的觀察方法為：將樣品取出小室，用棉簽擦去上室中的細胞，并用蘇木素伊紅染色，用樹脂膠將其封片。400倍顯微鏡下在上下左右中五個不同的視野內將侵襲細胞進行計數，取平均。

1.4Western blot

將轉染前后胃癌細胞置于細胞裂解液中，離心分離收集。配置一定含量的分離膠和濃縮膠，將樣品與緩沖液等體積進行混合，并用蛋白質對參照物進行標記。電泳后使用清水以及緩沖液進行清洗，利用電轉移法進行轉膜。然后清洗干燥，加脫脂粉后封閉過夜。ECL試劑盒內的溶液等體積混合后滴加到膜上，溫室孵育后用X線進行膠片曝光[2]。

1.5明膠酶活性檢測

將細胞進行接種后，進行培養，然后離心分離去除細胞碎片，然后取長層液加入緩沖液后進行點樣。電泳結束后，浸入孵育液中進行孵育，然后使用考馬斯亮藍進行染色，然后使用脫色液進行脫色，指導顯示出白色條帶為止。清洗觀察。

1.6統計學分析

采用SPSS 15.0 統計學軟件處理數據，結果采用均數±標準差表示， P<0.05為差異具有統計學意義。

2結果

2.1轉染前后MKN-28胃癌細胞中p16蛋白的表達

進行轉染重組質粒p16的實驗組中在明確的蛋白位置出現p16的特異性目的蛋白質條帶，但是轉染空質粒以及轉染前并沒有出現這中特異性條帶。

2.2轉染前后MKN-28胃癌細胞的穿膜能力

顯微鏡下的細胞計數顯示，隨著實驗時間的不斷增長，具有侵襲能力的細胞數量呈增加的趨勢。轉染后胃癌細胞穿透基底膜的數量與為傳染相比有很大程度上的減少，雖然在實驗進行10h、20h的時候轉染前后差異較小（p>0.05），但是30h以后，轉染前后期差異較大（p<0.05），具有統計學意義。還能夠看出，未轉染和空質粒轉的情況下，侵蝕細胞數沒有很大差異。具體見表1。

2.3 轉染前后MKN-28胃癌細胞明膠酶活性的情況

聚丙烯酰胺凝膠電泳的結果顯示，轉染后細胞的負染帶寬度比轉染前顯著變窄，并且亮度也隨之減弱，其轉染前的積分吸光度值為31.2±0.56，轉染后為27.8±0.51，兩者相比具有統計學意義（P<0.05）。轉染p16基因的胃癌細胞其基質膜降解和侵襲轉移能力都有所下降。

3討論

根據國內外大量的研究資料顯示[3]，抗遺傳基因家族可以通過對腫瘤細胞間或者是腫瘤細胞外的細胞基質的作用進而影響到腫瘤細胞的浸潤以及轉移的能力，所以這里基因在控制腫瘤細胞轉移的過程中顯示出非常重要的作用。目前臨床醫學中已經證實，p16與胃癌細胞的轉移具有很大的關系[4]。

侵襲、轉移是胃癌等惡性腫瘤最為基本的性質，防止其轉移和侵襲是降低死亡率的主要方法之一。而這些腫瘤細胞的運動能力是使其自身發生轉移的重要作用。其主要的侵襲轉移過程是先通過膜表面受體與基底膜發生粘附，然后它會釋放出蛋白明膠酶并且將基底膜進行分解，之后才會運動穿過基底膜[4]。而p16基因可能會使其釋放的明膠酶活性降低甚至是失去活性進而不能夠使基底膜受到分解，所以會抑制癌細胞的轉移與運動。

故本次研究采用p16基因作為胃癌細胞轉移抑制劑，旨在探討它對胃癌細胞的轉移的抑制作用。研究結果顯示，在胃癌細胞MKN-28進行轉染后，在明確的蛋白位置出現p16的特異性目的蛋白質條帶；轉染后胃癌細胞穿透基底膜的數量與為傳染相比有很大程度上的減少，雖然在實驗進行10h、20h的時候轉染前后差異較小（p>0.05），無統計學意義，但是30h以后，轉染前后期差異較大（p<0.05），具有統計學意義。并且進過聚丙烯酰胺凝膠電泳測試后發現轉染后細胞的負染帶寬度比轉染前顯著變窄，其并且轉染前的積分吸光度值為31.2±0.56，轉染后為27.8±0.51，兩者相比具有統計學意義（P<0.05）。

故p16基因對于抑制胃癌細胞的轉移可能是通過對癌細胞的侵襲和運動能力的控制得以實現的，p16可以有效地對胃癌細胞的轉移進行控制，為以后治療研究胃癌的轉移機制提供了依據。

參考文獻：

[1]魏國華，楊春雨，楊靜，高志安.Hp感染與p16基因甲基化在胃癌發生中的作用[J].腫瘤防治研究，2011，38（1）：51-54.

[2]王犇，呂志發，謝勇.幽門螺桿菌感染、P16基因甲基化與胃癌[J].基礎醫學與臨床，2014，34（9）：1301-1304.

[3]周小瀟，鄧鑫，梁健，蔣曼君.胃寧顆粒對胃癌前病變基因甲基化的相關調控[J].時珍國醫國藥，2014，25（5）：1037-1040.

[4]許春偉，葛暢，王魯平.p16基因甲基化與結直腸鋸齒腺瘤的Meta分析[J].診斷病理學雜志，2013，20（12）：790-791+793.