山東省3個克氏原螯蝦地理群體線粒體COⅠ基因的序列差異分析

楊玲　李寧　朱樹人等

摘要 利用PCR技術擴增山東境內的3個克氏原鰲蝦地理群體（濟南小清河、東平湖和微山湖）CO Ⅰ基因片段，得到長度約為874bp的片段，分析比較了3群體87尾克氏原螯蝦CO Ⅰ基因序列的變異和遺傳結構。結果顯示，87條序列共檢測到8個變異位點，存在6種單倍型。單倍型多樣性（H）為0.174，核苷酸多樣性（Pi）為0.0036，單倍型多樣性（H）以東平湖群體最高（0.243 ），微山湖群體其次（0.204），小清河群體最低（0.000）；3群體的核苷酸多樣性（H）均較低（<0.001）。分子變異等級分析（AMOVA）表明，3群體間總的遺傳分化指數（Fst）為0.023 85（P>0.05），群體間的遺傳變異僅占總遺傳變異的2.38%，而97.62%的遺傳變異源于群體內，群體間遺傳分化指數與遺傳距離均較低。表明山東克氏原鰲蝦野生群體的遺傳多樣性較低，具有較低的遺傳分化水平。

關鍵詞 克氏原鰲蝦； CO Ⅰ；遺傳多樣性

中圖分類號 S917；Q958.1 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）20-041-04

Abstract By PCR amplification， partial CO Ⅰ sequences with an aligned length of 874 bp were obtained from 3 Procambarus clarkii geographical population （Xiaoqing River in Jinan， Dongping Lake and Weishan Lake） in Shandong Province. Variation and genetic structure of partial CO Ⅰ sequences were analyzed from 87 individuals of these populations. A total of 6 haplotypes and 8 variable sites were detected. The highest haplotype diversity was in Dongping Lake population （0.243）， while the lowest haplotype diversity was Xiaoqing River population （0.000）. AMOVA showed that the FST among 3 population were 0.023 85 （P>0.05）. Genetic variation among populations accounted for only 2.38% of the total genetic variation， while 97.62% of genetic variation was from groups. Index of genetic differentiation and genetic distance between groups were lower. Results indicated that the genetic diversity of these 3 wild populations was low， and the 3 wild populations had lower genetic differentiation.

Key words Procambarus clarkii； CO Ⅰ； Genetic diversity

克氏原鰲蝦（Procambarus clarkii） 俗稱小龍蝦，屬螯蝦科原螯蝦屬，其肉味鮮美， 高蛋白低脂肪， 富含鈣、磷、鐵等礦物質，深受消費者喜愛?，F已廣泛分布于我國中東部地區十余個省市，成為一些湖泊和溝渠的優勢種群[1]，是我國重要的水產經濟物種。分子標記是分析群體遺傳多樣性的一種有效手段，學者利用AFLP、SSR、ISSR、RAPD等方法對克氏原螯蝦群體的遺傳多樣性進行研究，黃羽等[2]、宋亮等[3]利用AFLP方法進行克氏原螯蝦遺傳多樣性分析，揭示了長江中下游地區6個群體的遺傳變異主要存在于群體內，隨州、濟南、寧波和常熟4群體具有豐富的遺傳多樣性，且群體間存在較明顯的遺傳分化；王長忠等[4]、邢智珺等[5]利用SSR方法進行了克氏原螯蝦遺傳多樣性分析，揭示了長江4個群體遺傳多樣性處于中等水平，江蘇8個地理群體遺傳多樣性水平較高且群體間存在中度分化；韓曉磊等[6]對2個克氏原螯蝦群體遺傳多樣性進行了ISSR分析，顯示2野生群體存在一定程度的遺傳分化，遺傳變異主要存在于群體內個體間；張龍崗等[7]、張瑋等[8]分別對克氏原螯蝦不同野生群體進行了遺傳差異的RAPD分析。利用線粒體細胞色素C氧化酶Ⅰ亞基（CO Ⅰ）基因對克氏原螯蝦群體遺傳多樣性的研究相對較少，筆者利用CO Ⅰ基因對山東省內3個克氏原螯蝦野生地理群體的遺傳多樣性狀況、遺傳結構及遺傳變異水平進行本底調查，以期為其種群遺傳多樣性評估、種質資源保護和遺傳育種提供分子生物學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

克氏原螯蝦分別采自于山東濟南小清河（QH）、濟寧微山湖（WS）和泰安東平湖（DP）的野生群體，每組群體樣本數量為28～31個； PCR引物由上海生工生物技術有限公司合成；DNA提取試劑盒（SK1206）購自上海生工生物技術有限公司；Taq DNA聚合酶、dNTP 、MgCl2、Marker等為大連寶生物工程有限公司生產；PCR儀為Takara TP650型。

1.2 方法

1.2.1

基因組DNA的提取。取克氏原螯蝦肉約20 mg，用DNA提取試劑盒提取樣品基因組DNA，經OD260/OD280比值和瓊脂糖凝膠電泳檢測濃度和純度。

1.2.2

引物設計及PCR擴增。根據GenBank（NC_016926.1）中的相應序列，設計并合成一對引物，用于CO Ⅰ基因序列的擴增，引物序列為

CO ⅠS： 5′ACGCAACGATGATTTTTTTCT3′；

CO ⅠA： 5′CATCCATCCCTACCGTAAATA 3′。

PCR擴增體系50 μl，擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s， 51 ℃退火50 s，72 ℃ 延伸50 s，40個循環；72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送上海生工生物技術有限公司，純化后采用上述引物進行雙向測序。

1.2.3

序列分析。所測得的DNA序列經DNASTAR軟件拼接并輔以人工校，與從GenBank中下載的克氏原螯蝦相應序列用Clustal W方法進行比對分析和確定長度，采用MEGA 5.2 軟件統計序列的堿基組成和轉換/顛換比率（Ts/Tv ratios）、變異位點，采用Kimura 2parameter模型計算群體間的遺傳距離，采用Kimura 2parameter距離矩陣，鄰接法（NeighborJoining，NJ）構建單倍型分子系統樹，自舉檢測（bootstrap）1000次計算各分支置信度；用DNASP V5計算單倍型多樣性指數（Hd）和核苷酸多樣性指數（π）；使用Arlequin3.5軟件中的分子變異分析（AMOVA）方法估算遺傳變異在群體內和群體間的分布及遺傳分化指數（Fstatistics，Fst）。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增結果

采用引物CO ⅠS和CO ⅠA對3個不同地理群體克氏原螯蝦的基因組DNA進行PCR擴增，結果都擴增出一條約900 bp條帶（圖1）。

2.2 CO Ⅰ基因片段的序列分析

2.2.1

序列分析。對克氏原螯蝦3群體87個樣本線粒體CO Ⅰ基因進行了測序，結果經DNASTAR軟件拼接并輔以人工校對，去除部分端序列后，獲得874 bp的片段，經BLAST分析，與GenBank（NC_016926.1）中的克氏原螯蝦CO Ⅰ基因片段同源性高達99%，確定該產物為克氏原螯蝦CO Ⅰ基因的部分序列。

用CLUSTALW軟件對測得序列及GenBank中（NC_016926.1）的同源序列進行比對分析，共有8個變異位點（占位點總數的0.9%），其中有5個轉換（transition），3個顛換（transversion），轉換顛換比（Ts/Tv）為1.67∶1.00， 變異位點多發生在第3密碼子上，沒有堿基的插入與缺失。在編碼的296個氨基酸序列中，有1處氨基酸替代，由密碼子第一位點上的核苷酸替代引起。

87個樣本共檢測到6種單倍型（表1），其中3群體的共享單倍型1個（Hap1），單倍型Hap2、Hap3、Hap4為DP群體所特有，單倍型Hap5、Hap6為WS群體所特有，即DP 群體擁有4種單倍型，WS群體有3種單倍型，而QH群體只有1種單倍型。除共享單倍型外的5種單倍型出現頻率較低，只有1～2個樣本。

2.2.2

堿基組成和遺傳距離。

采用MGEA 5.2軟件統計3個群體克氏原螯蝦CO Ⅰ基因部分序列的堿基組成和G+G含量（表2）。G+C含量（32.0%）顯著低于A+T含量（68%），其中堿基C的含量最低，只有12.1%，且在1、2、3位的含量變化很大，分別為12.0%、23.4%和1.0%。DP群體內的相對遺傳距離（Pdistance）為0～0.007，WS群體內的遺傳距離為0～0.002，QH群體內的遺傳距離為0。

克氏原螯蝦CO Ⅰ基因6種單倍型序列間的遺傳距離見表3，利用Kimura雙參數模型計算，置信度估算采用Kimura的雙參數法，重復數1 000，結果顯示各單倍型間的遺傳距離在0.001～0.007。

2.2.3

不同群體遺傳多樣性及遺傳分化分析。利用DnaSP 5.1軟件進行3群體克氏原螯蝦CO Ⅰ基因遺傳多樣性分析（表4），結果表明，DP和WS群體具有較高的單倍型多樣性（Hd），分別為0.243和0.204，而小清河群體單倍型多樣性非常低，為0。3群體核苷酸多樣性（Pi）水平與平均核苷酸差異數（K）都較低。

分子變異等級分析（AMOVA）結果表明，群體間遺傳分化指數Fst=0.023 85（ P>0.05），表明在整個遺傳變異中不同群體間的遺傳分化只占2.38%，其余97.62%的遺傳分化來自群體內的個體間。群體間的遺傳分化指數Fst及3群體間的遺傳距離見表5，顯示3群體間DP和WS間的遺傳分化指數最低（Fst=-0.004 82），DP和QH群體間的遺傳分化指數最高（Fst=0.052 59），表明根據線粒體CO Ⅰ基因的序列，3個群體中沒有顯著的遺傳分化（P>0.05）。

從3群體間的遺傳距離來看，DP和WS群體的遺傳距離最大（0.000 42），DP和QH群體的遺傳距離最?。?.000 12），表明遺傳距離與地理距離沒有相關性。

2.2.4

系統發育和聚類分析。根據6個單倍型序列和GenBank中檢索的同源序列（NC_016926.1），采用雙參數模型（Kimura 2parameter）作為距離參數，鄰接法（neighberjoining，NJ）構建系統進化樹，自舉檢測（bootstrap）1000次計算各分支置信度（圖2）。由圖2可知，Hap1、Hap2和GenBank匯成一支，另外4個單倍型匯成一支，可以看出DP群體擁有的4種單倍型在各分支上都有分布，各群體間存在較為廣泛的共享單倍型，未表現出明顯的地理位置與單倍型之間的對應關系。

利用MGEA 5.2軟件構建了87個克氏原螯蝦個體的UPGMA系統進化樹（圖3），也揭示了克氏原螯蝦山東3群體不是按照地理位置形成對應族群的，絕大多數個體聚為一大類后和WS群體的部分個體群聚為一支， DP群體的部分個體自成一支。

3 討論

動物線粒體 CO Ⅰ基因進化速度較快，適合種群水平差異的檢測，也可用于種間分析，彭士明等[9]、馬凌波等[10]、姜虎成等[11] 、朱立靜等[12]通過分析銀鯧、青蟹、日本沼蝦、四角蛤喇等物種群體的線粒體CO Ⅰ基因序列差異研究其遺傳結構和系統演化。該研究通過分析山東3個不同地理群體克氏原螯蝦CO Ⅰ基因序列的差異來探討其遺傳結構、遺傳分化和進化關系。

3.1 遺傳多樣性

種群內和種群間的遺傳多樣性水平是反映物種遺傳背景的科學資料，該研究表明，在克氏原螯蝦3群體87個樣本擴增的 CO Ⅰ基因874 bp片段中，存在8個突變位點，有6種單倍型。3群體核苷酸多樣性（Pi）為0.000 29±0.000 12，平均核苷酸差異數（K）0.251±0.082。單倍型多樣性分析表明，DP和 WS群體較高，QH群體最低，與張龍崗等[7]研究的群體遺傳多樣性為WS >DP >QH的RAPD分析結果相似?？傮w而言，3群體的遺傳多樣性處于較低的水平，各群體間存在較為廣泛的共享單倍型，未表現出明顯的地理位置與單倍型之間的對應關系。這是因為克氏原螯蝦為外來物種，因奠基者效應或瓶頸效應的影響，由于克氏原螯蝦適應環境的能力非常強，環境的選擇壓力對其影響不大，形成基因突變和重組的概率很小，也未見由國外多次引入的報道，故其遺傳多樣性增加的可能性微乎其微，故而呈現出遺傳多樣性降低的現象。相對而言，DP和WS群體的遺傳多樣性水平比QH群體高，這是因為東平湖和微山湖一帶小龍蝦養殖業發展迅猛，和長江流域存在基因交流，人為因素使得其遺傳多樣性水平相對較高；而QH群體因生存環境相對封閉，克氏原螯蝦定居性較強，游泳能力弱，自身遷徙能力差，與其他群體缺乏交流，加之近些年過度捕撈，造成自然資源銳減和種群內近親交配，導致遺傳多樣性水平逐漸降低。王長忠等[4]利用AFLP技術進行研究，結果表明，克氏原螯蝦群體遺傳多樣性為寧波群體>隨州群體>濟南群體>常熟群體，也證明濟南群體處于較低的遺傳多樣性水平。

3.2 遺傳分化

AMOVA分析的Fst值是用來測量群體間遺傳分化的指標，Fst值越小說明群體間發生遺傳分化越低，一般認為Fst<0.05認為遺傳分化程度很??；0.050.25表示有顯著差異。該研究中群體間Fst=0.023 85（P>0.05），表明群體間的遺傳分化程度較低，在整個遺傳變異中群體間占2.38%，其余的遺傳變異來自于群體內，3個群體中DP和QH間的Fst值最大（0.052 59），兩者間的遺傳分化最大， DP和WS間的Fst最?。?0.004 82），即兩者間的遺傳分化最小，與張龍崗等[7]的研究結果類似。DP和WS群體間的遺傳距離最大，DP和QH群體間的遺傳距離最小（0.000 12），可能與DP和WS群體CO Ⅰ基因具有獨有單倍型有關，導致遺傳分化大的遺傳距離反而小。很多情況下，遺傳分化大的2個群體間遺傳距離不一定最大[13]，群體間Fst值雖然大小與其趨勢不一致，但該研究Fst值都不顯著，說明3個群體間不存在遺傳分化，這個Fst和遺傳距離不是對應的。

UPGMA系統關系樹也反映出它們的系統進化情況，絕大多數個體聚為一大類后和WS群體的部分個體群聚為一支， DP群體的部分個體自成一支，由此推測，可能東平湖群體更接近于外來原始種群，微山湖群體和小清河群體由東平湖群體演化而來。

該研究山東3個克氏原螯蝦野生群體間的遺傳分化較低，群體間還沒有形成互相隔離的遺傳結構，鑒于此，在克氏原螯蝦選育過程中，應以東平湖群體作為基礎群體，并適當引進外地良種，以獲得更多遺傳多樣性水平，促進克氏原螯蝦養殖業的健康發展。

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