HPLC同時測定復方藤烏軟膏中6種烏頭類生物堿含量

李美艷 赫清雪 王愛武

摘要：目的 建立高效液相色譜法（HPLC）同時測定復方藤烏軟膏中6種烏頭類生物堿含量的方法。方法 色譜柱為Agilent XDB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A為乙腈-四氫呋喃（25∶8），B為0.1 mol/L醋酸銨溶液（每1000 mL加冰醋酸0.5 mL），梯度洗脫；流速：1 mL/min；檢測波長：235 nm；柱溫：25 ℃。結果 烏頭堿在0.072～0.648 μg具有良好的線性關系（r=0.999 5），平均回收率為99.29%，RSD=1.25%；新烏頭堿在0.062～0.648 μg具有良好的線性關系（r=0.999 5），平均回收率為99.12%，RSD=0.85%；次烏頭堿在0.064～0.384 μg具有良好的線性關系（r=0.999 8），平均回收率為99.57%，RSD=1.07%；苯甲酰烏頭原堿在0.056～0.672 μg具有良好的線性關系（r=0.999 2），平均回收率為98.11%，RSD=0.61%；苯甲酰新烏頭原堿在0.055～0.993 μg具有良好的線性關系（r=0.999 9），平均回收率為99.27%，RSD=1.10%；苯甲酰次烏頭原堿在0.078～0.702 μg具有良好的線性關系（r=0.999 8），平均回收率為99.08%，RSD=1.38%。結論 本方法操作簡便、靈敏度高、重復性好，結果準確，可作為復方藤烏軟膏中烏頭類生物堿的含量測定方法。

關鍵詞：復方藤烏軟膏；烏頭堿；新烏頭堿；次烏頭堿；苯甲酰烏頭原堿；苯甲酰新烏頭原堿；苯甲酰次烏頭原堿；高效液相色譜法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.09.024

中圖分類號：R284.1 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2015）09-0087-04

Simultaneous Determination of 6 Aconitum Alkaloids in Compound Tengwu Ointment by HPLC LI Mei-yan1，2， HE Qing-xue1，2， WANG Ai-wu1 （1.Shandong Provincial Hospital Affiliated to Shandong University， Jinan 250021， China；2.Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 250355， China）

Abstract：Objective To establish an HPLC method for the simultaneous determination of the 6 aconitum alkaloids in compound Tengwu Ointment. Methods Chromatographic column was Aglient XDB-C18 column （4.6 mm × 250 mm， 5 μm）， with the mobile phase A of acetonitrile- tetrahydrofuran （25∶8）， phase B was 0.1 mol/L ammonium acetate solution （0.5 mL acetic acid added to the 1000 mL） with gradient elution；the flow rate was 1 mL/min；the detection wavelength was set at 235 nm；the column temperature was 25 ℃. Results Aconitine was in the good linear range of 0.072-0.648 μg （r=0.999 5）， with the average recovery of 99.29%， RSD=1.25%. Mesaconitine was in the good linear range of 0.062-0.648 μg （r=0.999 5）， with the average recovery of 99.12%， RSD=0.85%. Hypaconitine was in the good linear range of 0.064-0.384 μg （r=0.999 8）， with the average recovery of 99.57%， RSD=1.07%. Benzoylaconine was in the good linear range of 0.056-0.672 μg （r=0.999 2）， with the average recovery of 98.11%， RSD=0.61%. Benzoylmesaconine was in the good linear range of 0.055-0.993 μg （r=0.999 9）， with the average recovery of 99.27%， RSD=1.10%. Benzoylhypaconine was in the good linear range of 0.078-0.702 μg （r=0.999 8）， with the average recovery of 99.08%， RSD=1.38%. Conclusion This method is simple， sensitive， repeatable and accurate， which can be used for determination of aconitum alkaloids in compound Tengwu Ointment.

Key words：compound Tengwu Ointment；aconitine；mesaconition；hypaconitine；benzoylaconine；benzoylmesaconine；benzoylhypaconine；HPLC

復方藤烏軟膏是山東大學附屬省立醫院骨傷科專家與藥學人員遵循中醫藥理論共同研制的傳統中藥制劑，由雞血藤、生川烏、生草烏、自然銅等組成，具有消腫止痛、續筋接骨等功效，主要用于治療運動勞損、急性扭傷、挫傷、閃傷及輕度骨折引起的疼痛，臨床應用30余年療效較好。

復方藤烏軟膏中的生川烏、生草烏含有烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿等烏頭類生物堿，既是毒性成分又是有效成分[1]。我們前期對其制備工藝及皮膚安全性進行了研究[2]。本研究采用高效液相色譜法（HPLC）建立復方藤烏軟膏中6種烏頭類生物堿的含量測定方法，為更好地控制其質量、進一步推廣和擴大應用奠定基礎。

1 儀器與試藥

Waters 600F高效液相色譜儀（Waters2996紫外檢測器，Empowers色譜工作站），Agilent XDB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；CP2250型電子分析天平（奧豪斯國際貿易有限公司）；BSA223S電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；KQ-600DB型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

復方藤烏軟膏樣品（批號分別為20140508、20140711、20140829），山東大學附屬省立醫院制劑室制備；烏頭堿對照品（批號110720-200410，純度≥98%）、新烏頭堿對照品（批號0799-9403，純度≥98.3%）、次烏頭堿對照品（批號0798-9403，純度≥98.6%）均購自中國食品藥品檢定研究院，苯甲酰烏頭原堿對照品（批號RFS-B-110305，純度≥98%）、苯甲酰新烏頭原堿對照品（批號RFS-B-100713，純度≥98%）、苯甲酰次烏頭原堿對照品（批號RFS-B-110328，純度≥98%）均購自成都瑞芬思生物科技有限公司；乙腈、四氫呋喃為色譜純，水為雙蒸水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent XDB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）；流動相A為乙腈-四氫呋喃（25∶8），流動相B為0.1 mol/L醋酸銨溶液（每1000 mL加冰醋酸0.5 mL），梯度洗脫（0→35 min，17%→25%A；35→60 min，25%A）；檢測波長：235 nm；柱溫：25 ℃；流速：1 mL/min。理論板數按苯甲酰新烏頭原堿峰計算應不低于3000。在此色譜條件下，6種烏頭類生物堿均與其他組分能達到較好分離。色譜圖見圖1。

3.苯甲酰次烏頭原堿；4.新烏頭堿；5.次烏頭堿；6.烏頭堿

圖1 復方藤烏軟膏中6種烏頭類生物堿HPLC圖

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿對照品適量，分別置于10 mL容量瓶中，加入0.05%鹽酸-甲醇溶液定容至刻度，制成每毫升含烏頭堿0.180 mg、新烏頭堿0.180 mg、次烏頭堿0.180 mg、苯甲酰烏頭原堿0.560 mg、苯甲酰新烏頭原堿0.460 mg和苯甲酰次烏頭原堿0.195 mg的對照品儲備液。

精密量取烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿及苯甲酰次烏頭原堿儲備液各2.0、2、0、1.0、1.0、1.2、2.0 mL，置于同一10 mL容量瓶中，加入0.05%鹽酸-甲醇溶液稀釋至刻度，制成每毫升含烏頭堿36 ?g、新烏頭堿36 ?g、次烏頭堿32 ?g、苯甲酰烏頭原堿56 ?g、苯甲酰新烏頭原堿55.2 ?g和苯甲酰次烏頭原堿39 ?g的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取復方藤烏軟膏約10 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加氨試液3 mL，加入異丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液30 mL，超聲處理（功率100 W，頻率40 kHz，溫度25 ℃）30 min，過濾，殘渣用異丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液洗3次，每次10 mL，合并濾液，回收溶劑，殘渣用0.05%鹽酸-甲醇溶液定容至2 mL，過0.45 ?m微孔濾膜，即得。

2.4 線性關系考察

分別吸取混合對照品溶液2、6、10、14、18 ?L，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄峰面積。以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，分別進行線性回歸，得回歸方程，結果見表1。

2.5 精密度試驗

取混合對照品溶液10 μL，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次，測定烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿峰面積RSD分別為0.92%、1.27%、1.69%、1.71%、2.12%、2.24%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗

取復方藤烏軟膏，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分別在0、2、4、6、8、12 h對樣品進行測定，記錄積分峰面積，結果供試品中烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿及苯甲酰次烏頭原堿峰面積的RSD分別為1.37%、1.56%、1.18%、0.94%、2.17%、1.89%，表明供試品溶液在12 h內基本穩定。

2.7 重復性試驗

取同一批復方藤烏軟膏，按“2.3”項下方法平行制備供試品溶液6份，按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄峰面積。測得樣品中烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿及苯甲酰次烏頭原堿峰面積的RSD分別為1.75%、2.15%、1.77%、1.41%、1.35%、1.88%，結果表明本方法重復性較好。

2.8 加樣回收率試驗

取6份已知含量的復方藤烏軟膏，每份約5 g，精密稱定，分別精密加入一定濃度的6種烏頭類生物堿混合對照品溶液，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，結果見表2。

2.9 含量測定

取3批復方藤烏軟膏，各約10 g，精密稱定，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，結果見表3。

3 討論

復方藤烏軟膏中，生川烏、生草烏所含的雙酯型生物堿（烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿）治療量與中毒量接近，經加工炮制后轉化為單酯型生物堿（苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿），毒性大大降低[3]。目前關于含有烏頭堿的中藥含量測定報道較多，但同時測定6種生物堿的方法少見。本研究對烏頭堿的提取方法、萃取溶劑和流動相的種類及梯度洗脫條件進行了反復考察和試驗，建立了同時測定復方藤烏軟膏6種烏頭類生物堿含量的方法。

參考烏頭類生物堿含量測定的相關報道[4-5]，以6種烏頭類生物堿含量為指標，考察了樣品中烏頭類生物堿的3種提取方法：①氨試液堿化，用乙醚提取后再用0.05 mol/L鹽酸萃取，最后用氨水調節pH到10， 再用乙醚萃取的堿化酸提法；②用0.05 mol/L鹽酸酸化，乙酸乙酯萃取，水層用氨試液調節pH到10，再用乙醚萃取的酸化堿提法；③氨試液堿化，用異丙醇-乙酸乙酯（1∶1）超聲提取。結果發現，法①干擾雜質最少，但提取率相對低，損失較多；法②萃取過程容易乳化，提取率也較低；法③提取率最高，先將樣品堿化，使烏頭類生物堿游離出來，再用有機溶劑提取的方法干擾少，簡便易行，提取效果較好。

對堿化后的萃取溶劑分別以乙醚、異丙醇-乙酸乙酯（1∶1）進行了考察，結果發現，乙醚作為提取溶劑，回收較為容易、雜質較以異丙醇-乙酸乙酯（1∶1）為溶劑者少，但提取率低于后者，原因可能為異丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液溶解范圍大于乙醚，故選擇異丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液作為提取溶劑。

參考文獻[6-8]考察了甲醇-水-氯仿-三乙胺、乙腈-0.1 mol/L醋酸銨溶液梯度洗脫、[乙腈-四氫呋喃（25∶8）]-[0.1 mol/L醋酸銨溶液（每1000 mL加冰醋酸0.5 mL）]梯度洗脫等流動相條件。結果發現，甲醇-水-氯仿-三乙胺體系，6種生物堿分離度不理想，出峰時間在20 min以內。乙腈-0.1 mol/L醋酸銨溶液體系，苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿及新烏頭堿分離度較好，出峰時間在20～45 min之間，但烏頭堿與次烏頭堿峰重疊，無法分離。通過調節pH、醋酸銨濃度等方法，發現醋酸銨濃度對樣品分離作用不大，當調節pH到9.5時，6種生物堿達到基線分離，色譜峰對稱性良好，但是pH 9.5為強堿性，對標準填料色譜柱損傷較大。最終選擇[乙腈-四氫呋喃（25∶8）]-[0.1 mol/L醋酸銨溶液（每1000 mL加冰醋酸0.5 mL）]梯度洗脫。

總之，本研究在提取溶劑、萃取方法及流動相等反復優選的基礎上，成功建立了HPLC同時測定復方藤烏軟膏6種烏頭類生物堿含量的方法，操作簡便可行、靈敏度高、重復性好、結果準確，不僅可作為復方藤烏軟膏的含量測定方法，也為含烏頭堿類其他相關制劑的含量測定提供了借鑒。

參考文獻：

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（收稿日期：2015-02-06）

（修回日期：2015-03-03；編輯：陳靜）