福建三明不同地理種源草珊瑚親緣關系ISSR分析

鄧思珊等

摘要：目的 研究福建草珊瑚基地不同地理種源的草珊瑚遺傳多樣性，構建親緣關系圖。方法 采用CTAB法提取葉子中DNA，ISSR法對45個種源的草珊瑚樣品進行DNA分子水平的分析評價，POPgen32軟件計算遺傳多樣性，建立基因樹譜，采用NTSYS軟件進行聚類分析。結果 6條ISSR引物共擴增出630條條帶，遺傳多樣性分析表明45個品種平均有效等位基因數為1.620 2，平均Nei's基因多樣性指數為0.364 5，平均Shannon信息指數為0.543 2。各位點遺傳多樣性程度也存在較大差別，Nei's基因多樣性指數最大值為0.497 2，最小值為0.1078；Shannon信息指數最大值為0.690 3，最小值為0.219 2。聚類分析結果顯示，以45個品種和14個位點的譜帶數據為原始矩陣，共獲得630個兩兩不同品種間的遺傳相似系數，不同組之間相似系數最大者為1.0，最小者為0.516。結論 福建三明種植的草珊瑚品種間存在豐富的遺傳變異，具有豐富品種的分子基礎。以0.610為閾值可以把45個不同地理種源的草珊瑚分為6個組。遺傳距離與種源地理遠近無明顯相關。

關鍵詞：草珊瑚；ISSR法；遺傳多樣性；聚類分析

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.09.023

中圖分類號：R282.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2015）09-0083-04

ISSR Analysis on Genetic Relationship of Fujian Sanming Sarcandra Glabra of Different Geographical Provenances DENG Si-shan1， LIU Hong-xu1， MENG Chun2， LIANG Yi-chi3， XU Rong-qing1， LIN Wen-jin1， ZHANG Ya-min1 （1.Fujian Academy of Medical Sciences， Fujian Provincial Key Laboratory of Medical Test， Fuzhou 350001， China；2.Fuzhou University， Fuzhou 350108， China；3.Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350108， China）

Abstract：Objective To study the genetic diversity in Fujian Sanming Sarcandra Glabra from different geographical provenances；To construct genetic relationship diagram. Methods DNA in leaves was extracted by CTAB. Analysis and evaluation of DNA molecular level of 45 samples of different geographical provenances were conducted by ISSR method. POPgen32 software was used to calculate the genetic diversity and establish gene trees. NTSYS software was used to carry out cluster analysis. Results Six ISSR primers amplified 630 bands. Genetic diversity analysis showed that the average effective number of alleles of 45 varieties was 1.620 2；the average Nei's genetic diversity index was 0.364 5；the average Shannon information index was 0.543 2. Each point had different levels of genetic diversity. Nei's genetic diversity index of the maximum value was 0.497 2， and the minimum value was 0.107 8；Maximum Shannon information index was 0.690 3， and the minimum value was 0.219 2. Cluster analysis results showed that 45 varieties and 14 loci band data were the primitive matrix. 630 genetic similarity coefficients between two different species were obtained. The maximum similarity coefficient among different groups was 1.0， and the minimum was 0.516. Conclusion Different varieties of Fujian Sanming Sarcandra Glabra exist abundant genetic variation and has the molecular basis of abundant species. Using 0.610 as the threshold value can divide Sarcandra Glabra from 45 different geographical provenances into 6 groups. The genetic distance and geographical distance was not related.

Key words：Sarcandra Glabra；ISSR；genetic diversity；cluster analysis

草珊瑚為金粟蘭科植物草珊瑚Sarcandra glabra （Thunb.） Nakai的全株，具有抗腫瘤、抗菌消炎、抑制流感病毒、促進骨折愈合及鎮痛等功效。在保健品、日用品等領域也廣泛應用，市場需求旺盛。草珊瑚分布在我國以福建、江西為代表的南方各省。福建三明位于武夷山脈與戴云山脈之間的匯水區，氣候溫和，雨量充沛，土層深厚，森林覆蓋率高，是草珊瑚生長的理想區域。近年來，福建三明草珊瑚已形成產業，成為全國最大的人工草珊瑚種植基地，優質種源四五十種，來自當地及福建、江西、浙江、廣東、廣西。在通過有效成分、生物量考察分析，科學篩選高產、質優的草珊瑚的研究之后[1]，有必要對不同地理種源的草珊瑚進行遺傳多樣性分析，從分子水平研究種質間的遺傳距離，為保護基地種質資源、評價植物道地性和藥材品質提供科學依據。

ISSR（inter-simple sequence repeat）是Zietkiewicz等于1994年發展起來的一種微衛星基礎上的分子標記[2]。其基本原理是：用錨定的微衛星DNA為引物，即在SSR序列的3'端或5'端加上2～4個隨機核苷酸，在PCR反應中，錨定引物可引起特定位點退火，導致與錨定引物互補的間隔不太大的重復序列間DNA片段進行PCR擴增。所擴增的ISSR區域多個條帶通過聚丙烯酰胺凝膠電泳得以分辨，擴增譜帶多為顯性表現。ISSR集隨機擴增多態性DNA（RAPD）、SSR技術的優點于一身，實驗操作簡單、快速、耗資少，遺傳多態性高，已廣泛應用于作物遺傳多樣性、種群親緣關系分析等方面[3-5]。本研究應用ISSR法對三明三元草珊瑚基地不同地理種源的45個草珊瑚樣品進行DNA分析評價。

1 儀器與試藥

UV-1800型雙光束紫外可見分光光度計（日本島津公司），ABI7300 PCR儀（美國ABI公司），DYCP-34A型電泳槽（北京市六一儀器廠），J-25型離心機（德國HERMAL公司），DYY-10C型電泳儀（北京市六一儀器廠），CTK-50凝膠成像儀（英國SYNGENE公司）。

引物、Mg2+、dNTPs、10×PCR緩沖液、TaqDNA聚合酶、λ-EcoT14I Digest DNA Marker，上海生工生物工程技術服務有限公司；三氯甲烷、異丙醇、乙醇、三水合乙酸鈉，西隴化工股份有限公司。

草珊瑚樣品于2011年1月福建三明三元區吉口采育場草珊瑚標準示范基地采集，來源信息見表1。摘取幼嫩葉片，陰干后置-20 ℃冷凍保存。樣品經福建省藥品檢驗所吳春敏主任藥師鑒定為金粟蘭科植物草珊瑚Sarcandra glabra （Thunb.） Nakai的全株。

2 方法

2.1 基因組DNA提取

采用CTAB大量提取法。稱取0.2～0.4 g新鮮或-20 ℃冷凍植物材料；把植物葉子和研缽一起放入-80 ℃冰凍20～60 min，CTAB放入62 ℃預熱；快速研磨葉子直至成粉末狀，加入少許預熱的CTAB繼續研磨，移入預熱好CTAB的離心管，置于65 ℃水浴30～45 min，期間搖動幾次；12 000×g離心15 min，取上清液轉移至新的離心管中；加入等體積氯仿混勻，靜置片刻，12 000×g離心10 min；將水相轉移至新的離心管中，用等體積氯仿再抽提1次；加入等體積異丙醇，混勻，-20 ℃放置10 min，12 000×g離心15 min；棄上清液，用70%乙醇洗滌沉淀，略晾干即可得到DNA粗制品；加入TE緩沖液，放入-20 ℃冰箱保存。

2.2 ISSR-PCR引物設計篩選

根據加拿大British Columbia大學公布的ISSR引物序列進行篩選，獲得引物序列，上海生工生物技術公司合成，從100條引物中篩選出6條擴增條帶清晰、多態性較高、穩定性良好的引物用于45個樣品的擴增，最終確定的引物為801（AT）8T、807（AG）8T、813（CT）8T、824（TC）8G、835（AG）8YC、840（GA）8YT。

2.3 ISSR-PCR擴增條件

對聚合酶鏈式反應的Taq酶用量、Mg2+濃度、模板DNA用量、磷酸堿基脫氧核苷酸/dNTPs濃度和引物濃度等進行了優化試驗。總容積25 μL，包括模板DNA 30 ng，Taq酶20 nkat，0.4 μmol/L引物，2 mmol/L Mg2+，0.250 mmol/L dNTPs，10×PCR buffer 2.5 μL。

擴增程序：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性30 s， 37 ℃復性30 min，72 ℃延伸80 s，40個循環，最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。反應結束后，將PCR產物中加入5 μL loading buffer，用4%聚丙烯酰胺凝膠電泳，溴乙錠染色，凝膠成像儀拍照。

2.4 統計分析

根據聚丙烯酰胺凝膠電泳結果，凝膠上相同遷移率位置上有DNA條帶記為1，沒有DNA條帶記為0，得到二元資料，形成0、1矩陣。采用POPgen32分析Nei's基因多樣性指數（He）和Shannon信息指數（I）。NTSYS2.10e軟件分析所得數據，計算Nei's遺傳距離，使用UPMGA法進行聚類分析，構建進化樹圖。

3 結果

3.1 擴增產物的ISSR多態性

用6條ISSR引物對45個不同地理種源的草珊瑚進行PCR擴增，共擴增出630條清晰條帶。穩定的條帶片段在250～2000 bp。圖1為引物UBC 840對45份草珊瑚ISSR擴增結果。引物序列及多態性分析見表2。通過POPgen32軟件對個位點的有效等位基因數（Ne）和及Shannon信息指數進行計算，結果表明，45個產地平均有效等位基因數為1.620 2，平均Nei's基因多樣性指數為0.364 5，平均Shannon信息指數為0.543 2。

3.2 草珊瑚種質資源的遺傳相似系數和遺傳距離

各位點遺傳多樣性程度存在較大差別，Nei's基因多樣性指數最大值為0.497 2，最小值為0.107 8；Shannon信息指數最大值為0.690 3，最小值為0.2192，說明所選的樣品間存在豐富的遺傳變異，不同產地的草珊瑚具有豐富品種的分子基礎。

3.3 聚類分析

用NTSYS軟件，以45個樣品和14個位點的譜帶數據為原始矩陣，共獲得630個兩兩不同種源間的遺傳相似系數，不同組之間相似系數最大者為1.0，最小者為0.516。親緣關系聚類樹狀圖見圖2，以0.610為閾值可以把45個不同種源樣品分為6個類群。第Ⅰ大類由19個種源組成，包括樣品24、10、14、19、12、11、31、25、33、8、26、3、45、37、21、42、22、34和2，第Ⅱ大類由14個種源組成，包括樣品29、9、35、44、28、43、13、32、16、38、4、39、6和20，第Ⅲ大類由2個種源組成，包括樣品41和27，第Ⅳ大類8個種源組成，包括樣品1、36、18、5、40、7、17和15，第Ⅴ大類為樣品23，第Ⅵ大類為樣品30。其中24和10，12、11、31、25、33、8、26和3，38和4遺傳距離高度一致。

4 討論

草珊瑚是一種重要的藥用植物資源，由于市場需求量大，現已無野生資源，人工栽培方式的不同造成草珊瑚具有多樣性。筆者參考了多篇有關草珊瑚DNA的實驗性文章[6-9]，大都僅停留在DNA提取和分子標記方法研究上，尚未見同一生境不同種源草珊瑚遺傳多樣性研究報道。本研究樣品取自福建三明草珊瑚種植基地，種源來源多，研究其親緣關系對保護基地種質資源、評價植物道地性具有重要意義。

研究結果表明，試驗擴增的ISSR片段多態性很高，不同種源間遺傳相似系數變幅較大。各位點遺傳多樣性程度存在較大差別，Nei's基因多樣性指數最大值為0.497 2、最小值為0.107 8，Shannon信息指數最大值為0.690 3，最小值為0.219 2，表明所選的不同地理草珊瑚種源間存在豐富的遺傳變異，具有豐富品種的分子基礎。同時表明，在長期的人工栽培和定向選擇培育過程中，不同地域和育種模式造成草珊瑚的種質變異和進化速率大大高于自然群，造成了DNA分子水平上的多樣性，具備較高的遺傳變異。無性繁殖技術的推廣應用，進一步造成了不同地域性草珊瑚DNA分子多樣性的維持。

聚類分析進一步表明，試驗所采用的草珊瑚可能主要由2種不同種質的品系發育而來。聚類樹狀圖表明，遺傳距離高度一致的樣品12（福建華安）、11（浙江金華）、31（福建明溪）、25（福建建陽）、33（福建明溪沙溪）、8（廣東梅州）、26（福建沙縣南霞）和3（浙江新余）來自不同省份的不同地區，以及24（福建邵武）和10（浙江衢州）、38（福建三明三元曹源）和4（江西贛州）來自不同省份，卻有較近的遺傳距離。結果表明，福建三明草珊瑚基地的不同地理種源的草珊瑚不能完全反映種源的地理分布特點，不存在種源區域性特點，親緣關系與產地來源的地理遠近距離并無明顯關系。不同來源草珊瑚的多態性，為分析中國不同地區草珊瑚的種植歷史、種植水平以及建立標準化種質資源圃提供重要參考。分子多態性是否與草珊瑚的有效成分存在關系，有待進一步研究。

參考文獻：

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（收稿日期：2015-01-09）

（修回日期：2015-02-02；編輯：陳靜）