結腸靶向護腸清毒微丸中大黃素在大鼠體內腸吸收及藥物動力學研究

孫萍等

摘要：目的 建立護腸清毒微丸灌胃后大鼠血漿和結腸組織中大黃素濃度高效液相色譜測定方法，探討試驗微丸在大鼠體內藥物動力學性質及結腸組織分布情況。方法 將Wistar大鼠隨機分為微丸組和普通膠囊組，分別予護腸清毒微丸和膠囊內容物灌胃后，于給定的時間點（1、2、3、4、5、6、8、12、24 h）從大鼠靜脈竇取血分析。處死大鼠，分離結腸組織，進行提取分析。色譜條件：Phenomenex C18柱（4.6 mm×150 mm，10 ?m），流動相為甲醇-0.1%冰醋酸溶液（80∶20），流速1 mL/min，檢測波長254 nm。結果 大黃素在0.102～20.40 ?g/mL范圍內線性關系良好?；貧w方程分別為：血漿溶液A=76 825C+3567.8，r=0.999 4（n=6）；結腸組織溶液A=75931C+3384.2，r=0.999 0（n=6）。日間精密度和日內精密度均<4.0%，提取回收率>90.0%。微丸組大鼠血液和結腸組織中所含大黃素的藥物動力學參數T1/2和Tmax較普通膠囊組有所延長，Cmax和AUC0-24較普通膠囊組明顯提高。結論 護腸清毒微丸具有控釋和結腸靶向的作用。

關鍵詞：護腸清毒微丸；大黃素；結腸靶向；藥物動力學

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.09.022

中圖分類號：R285 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2015）09-0079-04

Pharmacokinetic and Intestinal Absorption Study on Rats of Emodin in Colon-Targeted Huchang Qingdu Pellets SUN Ping1， MA Chuan-jiang1， LIU Le-yang2 （1.Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 250011， China；2.Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 250000， China）

Abstract：Objective To establish an HPLC method for concentration determination of emodin in plasma and colon tissues after gavage with Huchang Qingdu Pellets；To explore pharmacokinetic properties and colon tissue distribution of Huchang Qingdu Pellets in rats. Methods Wistar rats were randomly divided into Pellets group and ordinary capsule group. Blood was taken after gavage with Huchang Qingdu Pellets or capsule content in given time points （1， 2， 3， 4， 5， 6， 8， 12， 24 h） from rat venous sinus and analyzed. Rats were put to death， and gastric and colon tissues were isolated and extracted for analysis. Chromatographic conditions：Phenomenex C18 column （4.6 mm × 150 mm， 10 μm）， the mobile phase of methanol-0.1% acetic acid solution （80∶20）， flow rate of 1 mL/min， the detection wavelength of 254 nm. Results Emodin was in good linear range of 0.102-20.40 μg/mL. The regression equations were：plasma solution A=76 825C + 3567.8， r=0.999 4 （n=6）；intestinal tissue solution A=75 931C + 3384.2， r=0.999 0 （n=6）. Day-to-day precision and within-day precision were less than 4%. The recovery rate was more than 90%. Pharmacokinetic parameters of T1/2 and Tmax of emodin in rat blood and intestinal tissues increased compared with the ordinary capsule group；Cmax and AUC0-24 were obviously improved compared with the ordinary capsule group. Conclusion Huchang Qingdu Pellets do have controlled release and colon targeting effect.

Key words：Huchang Qingdu Pellets；emodin；colon targeting；pharmacokinetics

結腸靶向護腸清毒微丸為山東中醫藥大學附屬醫院院內制劑，具有健脾清腸、化瘀解毒功效。處方由大黃、赤芍、紫草等10味中藥組成，臨床對肝病和腸源性內毒素血癥的治療有明顯療效[1-3]。結腸靶向護腸清毒微丸是對處方藥物進行提取精制后，加入果膠鈣制備微丸丸芯，經聚丙烯酸樹脂包衣，制備成結腸定位靶向給藥的控釋微丸。

大黃為方中君藥，具有瀉熱通腸、涼血解毒、逐瘀通經功效。大黃素為大黃的主要有效成分，有研究表明其對缺血再灌注損傷具有保護作用[4-5]。本試驗選擇大黃的主要有效成分大黃素為考察指標，比較結腸靶向護腸清毒微丸和普通膠囊內容物經大鼠口服后大黃素在血液及結腸組織中藥物動力學性質，為進一步探討護腸清毒微丸的作用機制和藥效學評價提供試驗依據。

1 儀器、試藥與動物

ER-182A型電子天平（日本）；85B-2型磁力加熱攪拌器（南通科學儀器廠）；SK1200B型超聲清洗器（上?？茖С晝x器有限公司）；D800C智能藥物溶出儀（天津大學無線電廠）；Biofuge Stratos全能臺式高速冷凍離心機（德國Heraeus公司）；Waters600高效液相色譜儀（美國Waters公司），Waters 2996二極管陣列檢測器（美國Waters公司），Microfluidizer（美國MicrofLudics公司）；80-2型離心沉淀機（江蘇金壇市中大儀器廠）；JY92-Ⅱ型超聲波細胞粉碎機（寧波新芝科器研究所）。

大黃素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110736-200629），護腸清毒微丸（自制，批號分別為20100314、20100316、20100318），護腸清毒膠囊內容物（自制，批號20100320），甲醇為色譜純，其他試劑均為市售分析純。

Wistar大鼠92只，雌雄各半，50日齡，體質量（200±20）g，山東大學實驗動物中心，動物合格證號SCXK（魯）20100004號。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

采用Phenomenex C18色譜柱（4.6 mm×150 mm， 10 ?m），流動相為甲醇-0.1%冰醋酸溶液（80∶20），流速1 mL/min，檢測波長254 nm，柱溫為室溫[6]。理論塔板數按大黃素峰計算不低于2500。

在此色譜條件下，大鼠血漿和結腸組織的微丸和普通膠囊樣品中大黃素均可檢出，且血漿和組織液中的內源性物質不干擾大黃素的測定。色譜圖見圖1、圖2。

2.2 給藥方案與血樣、結腸組織的采集

將90只Wistar大鼠隨機分為微丸組和普通膠囊組各45只，大鼠禁食12 h，用乙醚輕度麻醉后，經口插入聚乙烯管。微丸組通過聚乙烯管給大鼠口服護腸清毒微丸0.2 g，再灌入1 mL蒸餾水；普通膠囊組口服自制護腸清毒膠囊的內容物0.05 g（與微丸的含藥粉量相當），再灌入1 mL蒸餾水。于給定的時間點（1、2、3、4、5、6、8、12、24 h）用負壓針從大鼠靜脈竇取血0.5 mL，每個時間點取5只大鼠，血樣置肝素化試管中，3500 r/min離心10 min，分離血漿，分別標記，于-20 ℃以下保存待測[7]。取血后脊椎脫臼法處死大鼠，分離結腸組織，用生理鹽水沖洗干凈，稱重，將結腸組織分別切成小塊，封裝、標記，于-20 ℃以下保存待測。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 血漿樣品的制備 準確吸取大鼠血漿0.5 mL，置5 mL錐形試管中，加甲醇1.5 mL，渦旋混合3 min， 3000 r/min離心5 min，吸取上清液，用0.22 μm微孔濾膜過濾，進樣20 μL。

2.3.2 結腸組織液樣品的制備 取稱重后的結腸小塊，加入1 mL生理鹽水，20 000 r/min勻漿2 min，至組織全部分散，6000 r/min離心15 min，取上清液，加入3 mL甲醇，渦旋混合3 min，6000 r/min離心15 min，吸取上清液，用0.22 μm微孔濾膜過濾，進樣20 μL。

2.4 對照品溶液的制備

精密稱取大黃素對照品2.55 mg，置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并釋至刻度，搖勻，得對照品儲備液。

2.5 大鼠血漿及結腸組織標準曲線的建立

取對照品儲備液適量，分別加入空白血漿和結腸組織，配制成大黃素0.010 2 mg/mL的血漿儲備液和腸組織儲備液各25 mL。精密量取2種儲備液適量，分別配制成濃度為0.102、0.510、1.020、5.100、10.20、20.40 μg/mL的對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件分別進樣，測定峰面積（A），以進樣濃度（C）為橫坐標，A為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程。血漿溶液：A=76 825C+3567.8，r=0.999 4（n=6）；腸組織溶液：A=75 931C+3384.2，r=0.999 0（n=6）。大黃素在0.102～20.40 μg/mL范圍內線性關系良好。方法檢出限為0.002 μg/mL。

2.6 精密度試驗

分別用大鼠空白血漿和結腸組織配制低、中、高3種濃度（0.102、1.020、10.20 μg/mL）的含大黃素對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件，1 d內測定5次以計算日內精密度，每日測定1次連續5 d以計算日間精密度。結果3種濃度溶液的日內精密度：加空白血漿的RSD分別為2.51%、1.40%、0.99%，加結腸組織的RSD分別為1.92%、1.19%、0.50%。日間精密度：加空白血漿的RSD分別為3.39%、3.14%、2.59%，加結腸組織的RSD分別為3.42%、3.17%、2.66%。表明精密度良好，可滿足生物樣品分析方法要求。

2.7 穩定性試驗