金匱腎氣丸對腎陽虛大鼠睪丸轉化生長因子—β1和細胞色素P—19表達的影響

張曉紅等

摘要：目的 觀察金匱腎氣丸對腎陽虛及轉化生長因子-β1（TGF-β1）受體阻滯后大鼠轉化TGF-β1、細胞色素P-19（CYP19）、性激素水平和精子質量的影響，并探討其治療男性不育的作用機制。方法 將40只成年雄性SD大鼠隨機分為正常組、模型組、阻滯劑組、金匱組，每組10只。除正常組外，腺嘌呤混懸液灌胃制備腎陽虛不育模型。正常組給予生理鹽水灌胃，阻滯劑組注入大鼠睪丸間質TGF-β1受體阻滯劑，金匱組給予金匱腎氣丸水煎劑灌胃。經尾靜脈采血并摘取睪丸，采用免疫組化法、放射免疫法和電鏡觀察，檢測睪丸TGF-β1和CYP19的表達、性激素水平、精子密度和活率及睪丸形態學改變。結果 與正常組比較，模型組TGF-β1表達水平升高、CYP19表達水平降低（P<0.05）；與模型組比較，金匱組和阻滯劑組TGF-β1表達水平降低、CYP19表達水平升高（P<0.05）。與正常組比較，模型組大鼠精子數量較少且形態異常（P<0.05）；與模型組比較，金匱組和阻滯劑組睪酮（T）、雌二醇（E2）、精子密度和活率升高（P<0.05）；金匱組和阻滯劑組各項指標比較差異無統計學意義（P>0.05）。結論 金匱腎氣丸可改善腎陽虛模型大鼠精子質量和性激素水平，其機制可能是通過抑制睪丸TGF-β1受體表達、促進CYP19表達進而影響精子發育與增殖。

關鍵詞：金匱腎氣丸；精子；細胞色素P-19；轉化生長因子-β1；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.09.020

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2015）09-0072-04

Effects of Jingui Shenqi Pills on Expressions of Testicular TGF-β1 and CYP19 in Kidney-yang-deficiency Rats ZHANG Xiao-hong1， DONG Hai-jun2， WU Lei-tao2， ZHAO Jiao2， CHEN Yan-qiu2， YANG Qian-qian2， MA Jing2 （1.The Second People's Hospital of Jiuquan City， Jiuquan 735000， China；2.Xijing Hospital， Forth Military Medical University of PLA， Xian 710032， China）

Abstract：Objective To observe the effects of Jingui Shenqi Pills on the expressions of TGF-β1， CYP19， sex hormone level and sperm quality；To discuss its mechanism for the treatment of male sterility. Methods Forty adult male SD rats were randomly divided into normal group， model group， retardant group and Jingui Shenqi Pills group， 10 rats in each group. Except for the normal group， adenine was used to induce healthy rats to kidney yang deficiency and sterility model rats. Normal group was given normal saline for gavage；retardant group was injected with testicular mesenchyme TGF-β1；Jingui Shenqi Pills group was given Jingui Shenqi Decoction for gavage. Blood was taken through caudal vein. Immunohistochemical， radioimmunoassay and electron microscopy observation were used to detect the expressions of TGF-β1， CYP19， sex hormone level， sperm density and motility rate and testicular morphological changes. Results Compared with normal group， the expression of TGF-β1 in the model group increased and CYP19 decreased （P<0.05）. Compared with model group， the expression of TGF-β1 decreased and the expression of CYP19 increased （P<0.05）. Compared with normal group， the number of sperm quantity was small and paramorphia in model group （P<0.05）. Compared with model group， T， E2， sperm density and motility rate increased significantly in Jingui Shenqi Pills group and retardant group

基金項目：國家自然科學基金面上項目（30873206）；陜西省中醫藥管理局重點課題（13-JC049）

通訊作者：馬靜，E-mail：jingma@fmmu.edu.cn

（P<0.05）. There was no statistical significance among indexes in retardant group and Jingui Shenqi Pills group. Conclusion Jingui Shenqi Pills can improve sperm quality and sex hormone level of model rats with kidney-yang-deficiency， which mechanism is probably realized by inhibiting the expression of TGF-β1R and promoting the expression of CYP19 in testis to effect development and proliferation of sperm.

Key words：Jingui Shenqi Pills；sperm；CYP19；TGF-β1；rats

近年來，男性不育的發病率呈明顯上升趨勢，并已成為影響人類發展和健康的全球性的醫學和社會問題。尋找更有效的藥物和方法進行治療，已成為生殖醫學領域里的熱點問題?，F代研究表明，金匱腎氣丸可通過調節下丘腦-垂體-性腺軸的功能，治療男性少精、弱精[1-3]。前期研究顯示，睪丸抑制轉化生長因子-β1（TGF-β1）和細胞色素P-19（CYP19）的表達與精子發生有密切關系[4-5]，因此，本研究選用金匱腎氣丸干預雄性腎陽虛不育大鼠模型，觀察抑制TGF-β1受體（TGF-β1R）后，大鼠睪丸CYP19和TGF-β1的表達與精子數量和質量的關系，以期進一步探討金匱腎氣丸治療男性不育的作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物

選取5月齡雄性SD大鼠40只，SPF級，體質量（260±10）g，第四軍醫大學實驗動物中心，合格證號SCXK（軍）2013-007。普通飼料，定時定量喂食，自由飲水，光照12 h、黑夜12 h交替喂養。

1.2 藥物及制備

金匱腎氣丸組方按《金匱要略》記載（干地黃24 g，山藥12 g，山萸肉12 g，澤瀉9 g，牡丹皮9 g，肉桂3 g，附子3 g），飲片均由第四軍醫大學西京醫院藥劑科中藥房提供，將藥材煎煮濃縮至含原藥材1.35 g/mL， 4 ℃冰箱保存備用；SB431542準備：取1 mg SB431542，溶于2.6 μmol DMSO中。將含有SB431542的DMSO用1000 μmo1 PBS液稀釋。

1.3 主要試劑與儀器

TGF-β1R阻滯劑SB431542、兔抗大鼠CYP19單克隆抗體、兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體及臺盼蘭染色劑，美國Santa公司；羊抗兔試劑盒，武漢博士德生物技術公司；腺嘌呤，美國Sigma公司；性激素放射免疫分析試劑盒，北京中杉生物技術公司。體視解剖鏡（Nikon，SMZ1000），全自動精子分析儀SQAV（上海圣荷西醫療用品有限公司）。

2 實驗方法

2.1 造模、分組與給藥

SD大鼠適應性喂養3 d后，隨機分為正常組、模型組、金匱組、阻滯劑組，每組10只。參考文獻[6]方法，將腺嘌呤制成2 mL蒸餾水混懸液，造模大鼠連續灌胃150 mg/（kg·d），正常組灌服等量生理鹽水，給藥體積2 mL/d，連續30 d。各組大鼠均普通飼料喂養，自由飲食。成模后，金匱組給予大鼠金匱腎氣丸水煎劑13.5 g/（kg·d）灌胃，連續30 d[4]。尾部靜脈采血，脫頸處死，立即摘取睪丸組織并置于Bouin氏液中固定24 h，經70%、80%、90%、95%及100%梯度酒精逐級脫水后，進行石蠟包埋、切片以備相應檢測。阻滯劑組按試劑說明書給予大鼠睪丸間質內注射TGF-β1R阻滯劑SB431542，50 μmol/只。其他組灌服等量生理鹽水，連續30 d。

2.2 一般觀察

定期測量各組大鼠體質量。

2.3 血清性激素水平測定

將采集的血液離心，取血清，參照試劑盒說明書，檢測血清睪酮（T）、雌二醇（E2）、促卵泡素（FSH）和黃體生成素（LH）的水平。

2.4 精子密度和活率測定

采集精液，37 ℃水浴中孵育10 min，充分液化，置于全自動精子分析儀進行精子密度和活率測定。

2.5 細胞色素P-19、轉化生長因子-β1的表達測定

采用免疫組化染色，將睪丸組織切片經二甲苯脫蠟3次，每次10 min；置于100%、95%、90%、80%、70%梯度酒精各10 min；抗原修復20 min；PBS液洗5 min×3次，甲醇-H2O2室溫孵育30 min，封閉內源性過氧化物酶；PBS液洗5 min×3次，血清封閉，分別滴加1∶400兔抗大鼠TGF-β1及兔抗大鼠CYP19，4 ℃冰箱過夜，PBS液洗5 min×5次，滴加羊抗兔二抗于37 ℃恒溫箱孵育30 min，PBS液洗5 min×3次，滴加SABC，37 ℃恒溫箱孵育30 min；PBS液洗5 min×5次，DAB顯色；PBS液終止顯色，蘇木精胞核復染、封片，光鏡下檢測TGF-β1及CYP19的表達。

2.6 睪丸超微結構觀察

將睪丸組織切成2 mm×2 mm的小條，經初固定、后固定（pH 7.3～7.4），梯度酒精逐級脫水、Epon812包埋、固化、超薄切片機切片50～60 nm，3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，透射電鏡觀察睪丸超微結構。

3 統計學方法

采用SPSS17.0統計軟件進行分析。實驗數據以—x±s表示，組間比較采用方差齊性檢驗及方差分析，TGF-β1及CYP19表達均采用Kaplan-Meier法。P<0.05表示差異有統計學意義。