HPLC測(cè)定銀線草中酚酸的含量

袁琴琴

摘要[目的]采用HPLC方法測(cè)定不同部位不同采收季節(jié)銀線草中酚酸類含量。[方法]采用高效液相色譜法，色譜柱為Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相甲醇-0.1%甲酸線性梯度洗脫，流速為0.8 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)323 nm，柱溫25 ℃。[結(jié)果]銀線草中迷迭香酸、反丁烯二酸、綠原酸在測(cè)定范圍內(nèi)線性關(guān)系較好（r≥0.999 1），平均回收率為97.5%～105.1%；不同部位不同采收季節(jié)銀線草酚酸類含量存在一定差異。[結(jié)論]該方法操作簡(jiǎn)便、定量準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可用于銀線草中酚酸類含量的測(cè)定。

關(guān)鍵詞銀線草；HPLC；酚酸；含量測(cè)定

中圖分類號(hào)S567.23+9文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2015）31-074-03

Determination of the Phenolic Acids Content in Chloranthus japonicus Sieb. by HPLC

YUAN Qinqin1，2

（1.Department of Life Science， Heze University， Heze，Shandong 274000；2.Key Laboratory of Medicinal Resource and Natural Pharmaceutical Chemistry of Ministry of Education，National Engineering Laboratory for Resource Developing of Endangered Chinese Crude Drug in Northwest of China， Shaanxi Normal University， Xian，Shaanxi 710062）

Abstract [Objective]Determination of different parts and seasons of phenolic acids content in Chloranthus japonicus Sieb. by HPLC.[Methods]The chromatographic separations were obtained by the Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）with the gradient elution solvent system composed of methanol and 0.1%formicacid，the flow rate was 0.8 ml/min， the wavelength was set at 323 nm and the column temperature was maintained at 25 ℃.[Results]The linear ranges of fumaric acid， chlorogenic acid and rosmarinic acid were better （r>0.999 1）， the average recovery between 97.5%-105.1%.There was a certain difference of different parts and seasons of phenolic acids content in Chloranthus japonicus Sieb..[Conclusion]The method was simple， accurate quantitative and good reproducibility，which can be used for the determination of phenolic acids content in Chloranthus japonicus Sieb..

Key words Chloranthus japonicus Sieb.；HPLC；Phenolic acids； Content determination

銀線草（Chloranthus japonicus Sieb.）是金粟蘭科（Chloranthaceae）金粟蘭屬（Chloranthus Swartz）多年生的草本植物，以全草或根入藥，主要治瘀血腫痛、毒蛇咬傷、癤瘡腫毒等，一直作為民間中草藥被廣泛的使用。銀線草的化學(xué)成分復(fù)雜，主要含有倍半萜類、酚類、香豆素類、酰胺類、木脂素類、甾體及甾體皂苷類等[1-4]。銀線草中的酚酸類物質(zhì)是其主要活性成分之一，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，酚類成分具有良好的抗氧化、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗激素、抗血栓、抗變態(tài)反應(yīng)等活性[5-6]。由于它們特殊的生理作用，研究酚類化合物具有十分重要的意義。該試驗(yàn)采用HPLC法測(cè)定了銀線草不同采收季節(jié)不同部位的迷迭香酸、反丁烯二酸、綠原酸的含量，以期為銀線草資源的合理開(kāi)發(fā)利用提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)，也為進(jìn)一步對(duì)銀線草的活性成分研究奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試材。銀線草于2011年4～7月底采集于陜西省太白山，經(jīng)陜西師范大學(xué)生命科學(xué)院田先華教授鑒定為金粟蘭科金粟蘭屬植物銀線草（Chloranthus japonicus Sieb.）。

1.1.2試劑。甲醇（美國(guó)Fisher公司，色譜純）；甲酸（天津市天力化學(xué)試劑有限公司，分析純）；所用水均為超純水；迷迭香酸（批號(hào)07902PH），反丁烯二酸（批號(hào)11154-200001），綠原酸（批號(hào)110753200413），均來(lái)源于中國(guó)藥品生物制品檢定所。

1.1.3儀器。LC2010 AHT HPLC（日本SHIMADZU島津公司），SL202N 型電子秤（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司），MILLI-Q 超純水儀器（MILLIPORE公司），RE250AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀器（上海亞榮生化儀器公司），KQ5200超聲波清洗器（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司），色譜柱Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5μm，美國(guó)Phenomenex公司），SL202N 型電子秤（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）。

1.2方法

1.2.1樣品溶液的制備。銀線草不同采收期的根、莖、葉粉碎后過(guò)60目篩，各精密稱取1 g，置于20 ml帶塞錐形瓶中，2次加入5 ml甲醇，超聲30 min，提取2次，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后備用。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備。適量稱取反丁烯二酸、綠原酸和迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)品，溶于甲醇，分別配成1.0、0.5和0.502 mg/ml的溶液，溶液須經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后備用。

1.2.3色譜條件。色譜柱為Phenomenex C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫25 ℃；流速0.8 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)323 nm，進(jìn)樣量10 μl。低壓梯度洗脫條件分別為0～5 min，甲醇15%～25%；5～20 min，甲醇25%～30%；20～45 min，甲醇30%～40%；45～95 min，甲醇40%～60%。

1.2.4方法學(xué)考察。

1.2.4.1線性關(guān)系考察。精密吸取反丁烯二酸溶液1.0、3.0、5.0、8.0、12.0、16.0、25.0 μl，綠原酸1.0、3.0、5.0、8.0、12.0、16.0、20.0 μl，迷迭香酸1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、13.0、16.0 μl，在“1.2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，分別以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算其回歸方程。

1.2.4.2精密度試驗(yàn)。取按“1.2.2”方法制備的3種標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別進(jìn)樣5次，計(jì)算反丁烯二酸、綠原酸和迷迭香酸峰面積的RSD值。

1.2.4.3重現(xiàn)性試驗(yàn)。精密秤銀線草樣品，按“1.2.1”項(xiàng)進(jìn)行樣品提取，按“1.2.3”色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣5次，計(jì)算反丁烯二酸、綠原酸和迷迭香酸的RSD值。

1.2.4.4穩(wěn)定性試驗(yàn)。精密秤銀線草樣品，按照“1.2.1”項(xiàng)制備溶液，分別于0、4、8、16、24、48 h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算RSD值。

1.2.4.5加樣回收試驗(yàn)。精密稱取銀線草樣品2 g，每份分別加反丁烯二酸、綠原酸和迷迭香酸對(duì)照品2 mg，按照“1.2.3”色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算反丁烯二酸、綠原酸和迷迭香酸含量，計(jì)算樣品回收率和RSD，結(jié)果取5次平均值。

1.2.5樣品的含量測(cè)定。按“1.2.2”方法分別取不同月份不同部位的銀線草，按“1.2.4.1”方法對(duì)其反丁烯二酸、綠原酸和迷迭香酸的含量進(jìn)行測(cè)定。

2結(jié)果與分析

2.1標(biāo)品和銀線草樣品的HPLC色譜圖 按照“1.2.2”、“1.2.1”溶液制備方法和“1.2.3”色譜條件得到標(biāo)品和樣品HPLC色譜圖（圖1～2），由標(biāo)品圖譜和供試品溶液的圖譜可知，標(biāo)品和樣品中的反丁烯二酸、綠原酸和迷迭香酸出峰保留時(shí)間一致，樣品所測(cè)定的反丁烯二酸、綠原酸和迷迭香酸峰旁邊無(wú)明顯雜峰。

2.2方法學(xué)考察

2.2.1線性關(guān)系考察。按“1.2.4.1”方法操作，反丁烯二酸、綠原酸、迷迭香酸的線性回歸方程分別為Y=8.03×104X+3.47×104、Y=106X+4.86×105、Y=106X+2.65×105，其相關(guān)系數(shù)分別為0.999 4、0.999 7、0.999 1，表明反丁烯二酸、綠原酸、迷迭香酸分別在1.0～25.0、0.5～10.0、0.502～8.302 μg的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（表1）。

2.2.2精密度試驗(yàn)。按“1.2.4.2”方法操作，計(jì)算得出反丁烯二酸、綠原酸和迷迭香酸峰面積的RSD分別為1.6%、1.2%和2.4%，表明儀器的精密度良好。

2.2.3重現(xiàn)性試驗(yàn)。按“1.2.4.3”方法操作，計(jì)算得反丁烯二酸、綠原酸和迷迭香酸的RSD值分別為1.5%、1.9%和17%，表明該方法重現(xiàn)性較好。

2.2.4穩(wěn)定性試驗(yàn)。按“1.2.4.4”方法操作，計(jì)算得出反丁烯二酸、綠原酸和迷迭香酸的RSD值分別為2.3%、2.8%和1.6%，表明樣品溶液在48 h內(nèi)基本上穩(wěn)定。

2.2.5加樣回收試驗(yàn)。按“1.2.4.5”方法操作，測(cè)得銀線草中反丁烯二酸、綠原酸和迷迭香酸的加樣回收率（n=5）為97.5%～105.1%，RSD（n=5）分別為2.4%、1.9%、2.1%。

2.3銀線草不同采收季節(jié)、不同部位酚酸成分的含量測(cè)定方法確定并驗(yàn)證后，取不同月份不同部位的銀線草對(duì)其反丁烯二酸、綠原酸和迷迭香酸的含量進(jìn)行測(cè)定，從圖3可以看出，不同部位不同采收季節(jié)銀線草中酚酸的含量存在一定差異。反丁烯二酸主要存在于莖和葉中，且在4、5月份含量高于6、7月份；綠原酸主要存在于葉子中，且4、5、6月份葉里的含量遠(yuǎn)高于根和莖中，在4月份含量最高；迷迭香酸主要存在于葉子中，5、6、7月份葉里的含量遠(yuǎn)高于莖和根，在5月份含量最高。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2015年

3討論

在波長(zhǎng)為323 nm時(shí)，同時(shí)檢測(cè)反丁烯二酸、綠原酸、迷迭香酸3種成分，酚類化合物常帶有酚羥基，故在水中會(huì)發(fā)生部分解離，在洗脫時(shí)不會(huì)依次被洗脫，不能形成獨(dú)立的峰，所以在使用高效液相色譜進(jìn)行分離時(shí)，需在流動(dòng)相中加入少量的酸以抑制它的解離，以達(dá)到能夠進(jìn)行科學(xué)分析的效果[7]。該試驗(yàn)采用甲醇-0.1%甲酸水為HPLC分離銀線草酚類流動(dòng)相體系，且采用了梯度洗脫的分離模式。

《中國(guó)藥典》（2010）規(guī)定的金粟蘭科草珊瑚屬腫節(jié)風(fēng)藥材另一考察指標(biāo)是迷迭香酸，而該試驗(yàn)得出銀線草中迷迭香酸的含量高于《中國(guó)藥典》（2010）規(guī)定的0.02%[8]，可以為銀線草的質(zhì)量控制提供參考。

中藥材不同部位的化學(xué)成分含量相差比較大的現(xiàn)象普遍存在，這與化學(xué)成分在生物體中的合成部位和積累有一定的關(guān)系，因此在進(jìn)行化學(xué)成分研究時(shí)應(yīng)給予一定的重視。銀線草的地上和地下部分有效成分含量差異很大，而酚酸類物質(zhì)主要存在于葉和莖中，尤其在葉里含量遠(yuǎn)高于根，表明銀線草不同部位的生理活性可能會(huì)有所側(cè)重，在臨床應(yīng)用時(shí)應(yīng)加以區(qū)別。

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