利用PCR技術鑒別畜禽肉中鴨源性成分研究

張晶鑫 高玉時 樊艷鳳 唐修君 賈曉旭 顧榮 陸俊賢

摘要 [目的] 建立一種快速準確的鴨源性成分檢測方法。[方法]分別以線粒體16S rRNA 基因和COⅠ基因序列為靶位點設計鴨特異性引物，以常見畜禽肉（羊肉、牛肉、豬肉、兔肉、鴿肉、鵪鶉肉、雞肉、鴨肉、鵝肉）DNA為模板，進行PCR擴增，檢測引物的特異性和靈敏度。[結果]篩選的引物能夠有效地對鴨源性成分進行檢測，方便簡潔，靈敏度較高。[結論]該方法能夠快速有效地鑒別畜禽肉中鴨源性成分。

關鍵詞 鴨源性成分；16S rRNA 基因；COⅠ基因；PCR；鑒別

中圖分類號 S879.2；TS251.5 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）34-202-02

近年來，動物源性食品摻雜摻假等各種食品安全事件頻發。在西方，一項對近千種肉制品的檢測分析表明，有近20%的產品存在標識與品種不完全相符的現象[1]。研究動物源性食品安全檢測技術，對食品動物源性成分進行鑒定，顯得尤為重要。

PCR技術由于其操作簡便、快速高效等特點，已在國內外肉類摻假研究中得到廣泛應用，并取得創新性成果[2-4]，目前已成為肉制品品種鑒別最常用的方法之一。動物線粒體基因組DNA序列具有高度的物種特異性，是設計肉類成分定性檢測的首選靶點，包括細胞色素b（Cyt b）基因、12S rRNA、16S rRNA、DLoop基因等[5-7]。

筆者選擇16S rRNA基因和COⅠ基因序列為目標基因，通過基因序列比對，設計篩選出鴨特異性引物，以羊肉、牛肉、豬肉、兔肉、鴿肉、鵪鶉肉、雞肉、鴨肉、鵝肉9種動物DNA為模板，建立運用PCR技術鑒別畜禽肉中鴨源性成分快速鑒別方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 以市售合格的牛、羊、豬、兔、鴿、鵪鶉、雞、鴨及鵝肉為試驗素材，各物種肉樣充分攪碎混勻，-20 ℃保存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取。

采用離心柱式組織基因組DNA小量抽提試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取DNA。提取的總DNA樣品溶于100 μl洗脫液TE中，于-20 ℃保存備用。

1.2.2 引物設計與合成。

根據GenBank公布的鴨線粒體DNA（登錄號為KJ833587）16S rRNA基因和COⅠ基因序列，利用Primer Premier5.0軟件設計篩選特異性引物對，并送至上海生工生物工程有限公司合成。取適量引物用高壓滅菌后的超純水溶解，配制成10 μmol/L的儲備液。引物序列、Tm值與擴增片段大小見表1。

1.2.3 PCR擴增。20 μl PCR擴增體系：2×Tag Master Mix （南京博爾迪公司）10 μl，10 μmol/L引物各0.3 μl，模板1 μl，ddH2O 8.4 μl。

反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸60 s，共28個循環；最后72 ℃延伸4 min。

1.2.4 PCR產物檢測和測序 。

PCR反應完畢后將產物取出，利用1.5%瓊脂糖（Promega公司）凝膠電泳檢測，并割膠回收純化，交由上海華大公司進行測序，所有序列采用雙向測序，以便比對核實，測序結果與GenBank上已知序列進行比對。

1.2.5 靈敏度試驗。

將鴨肉DNA模板按梯度進行稀釋，分別稀釋10倍、102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍、108倍，觀察該方法靈敏度。

2 結果與分析

2.1 線粒體DNA 16S rRNA和COI基因PCR特異性檢測

將PCR產物測序結果與GenBank 上已知序列進行比對，結果顯示，鴨的測序結果與已發表序列（GenBank登錄號分別為KJ833587.1、KJ833586.1）的同源性均在99%以上，與預期基本一致，確定為鴨肉成分。

以羊肉、牛肉、豬肉、兔肉、鴿肉、鵪鶉肉、雞肉、鴨肉、鵝肉9種動物肌肉DNA為模板，分別對所設計篩選的鴨引物進行特異性研究。根據鴨線粒體16S rRNA設計的引物，只有鴨的DNA模板能擴增出222 bp的目的條帶（圖1）；利用鴨線粒體COⅠ基因設計的引物，只有鴨的DNA模板能擴增出96 bp的目的條帶（圖2）。

3 討論

肉與肉制品摻雜、摻假是目前食品質量控制面臨的重要挑戰。一些不法商家或個人為了追求自身利益以低價劣質的肉冒充高價優質的肉，嚴重侵犯了消費者合法權益。對食品中原料肉進行摻假、摻雜檢驗勢在必行，其重點是快速、準確地鑒定肉品成分來源。

近年來，PCR技術已逐步成為肉類種屬鑒定的核心方法[8-9]。何瑋玲等[10]基于動物線粒體細胞色素b基因的差異性位點，建立并優化多重PCR反應體系，實現4種肉類（豬肉、牛肉、羊肉和雞肉）的快速鑒別。Soares等[11]應用雙重PCR在豬肉中成功檢測到禽肉。Ghovvati等[12]基于線粒體12S rRNA和16S rRNA基因應用多重PCR技術對反芻動物、家禽和豬進行鑒別。陳冬等[2] 基于牛線粒體12S rRNA基因，設計通用引物，成功用于混合鮮牛肉及制品中牛種來源鑒別。

該研究主要根據鴨線粒體基因組編碼基因16S rRNA基因和COⅠ基因序列的位點差異設計特異性引物，進行PCR擴增檢測，對包括羊、牛、豬、雞、兔、鴿、鵪鶉、鴨、鵝9種動物在內的畜禽肉進行動物源性鑒別，經過多次重復試驗證明，所選定的鴨引物對只有在鴨DNA模板存在的情況下才會發生PCR擴增，檢測靈敏度較高，16S rRNA基因靈敏度達1.98×10-2ng/ul，COⅠ基因靈敏度達1.98×10-1ng/ul，建立了快速、準確的畜禽肉中鴨源性成分PCR鑒別方法。在下一步工作中，將開展16S rRNA和COⅠ基因序列熒光定量PCR技術，進一步研發食品中動物源性成分分析方法，為保障肉類產業健康發展、維護市場秩序提供有效保障。

參考文獻

[1]

BALLIN N Z， VOGENSEN F K， KARLSSON A H.Species determinationcan we detect and quantify meat adulteration？[J]. Meat science， 2009， 83（2）： 165-174.

[2] 陳冬，柏凡，周明亮，等.基于線粒體12S rRNA基因鑒別混合牛肉及制品的牛種來源[J].遺傳，2008，30（8）：1008-1014.

[3] YIN R H， BAI W L， WANG J M， et al. Development of an assay for rapid identification of meat from yak and cattle using polymerase chain reaction technique[J]. Meat science， 2009， 83（1）： 38-44.