COX-2在膽管癌中的表達及其選擇性抑制劑對膽管癌細胞生長的影響

楊博　馬亦龍★

COX-2在膽管癌中的表達及其選擇性抑制劑對膽管癌細胞生長的影響

楊博馬亦龍★

目的 評估環(huán)氧合酶-2（COX-2）抑制劑塞來昔布對膽管癌細胞株QBC939生長和凋亡的影響。方法 通過western blot實驗檢測COX-2蛋白在膽管癌標本、膽管癌細胞株QBC939和肝內膽管上皮細胞HIBEpiC中的表達水平；通過WST-1實驗檢測塞來昔布對QBC939細胞生長的影響；通過裸鼠荷瘤模型評估塞來昔布在體內對QBC939細胞生長的影響；通過凋亡實驗檢測塞來昔布對QBC939細胞凋亡的影響。結果 COX-2蛋白在膽管癌組織中表達水平顯著高于癌旁組織，在QBC939細胞中的表達水平顯著高于HIBEpiC細胞；塞來昔布在體內和體外均可顯著抑制QBC939細胞的生長；塞來昔布可誘導QBC939細胞發(fā)生凋亡。結論 COX-2抑制劑塞來昔布對膽管癌細胞的生長有顯著抑制作用，該作用可能與其誘導細胞凋亡有關。

膽管癌 環(huán)氧合酶-2抑制劑 凋亡

目前膽管癌缺乏標準規(guī)范的化療方案，眾多基礎實驗和臨床試驗均證明常規(guī)化療方案對膽管癌的療效并不顯著［1］。環(huán)氧合酶-2（COX-2）是人體合成前列腺素（PG）的限速酶，COX-2與腫瘤的關系密切，其過表達參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［2］；而以COX-2為靶點的COX-2抑制劑可顯著抑制腫瘤的生長［3］。但目前關于COX-2與膽管癌之間的關系并未完全闡明。本研究主要檢測COX-2在膽管癌組織中的表達狀況，以探討COX-2抑制劑對膽管癌細胞生長的抑制作用。

1　材料與方法

1.1材料 膽管癌細胞QBC939購自中科院上海分院細胞所細胞庫；肝內膽管上皮細胞HIBEpiC購自美國ScienCell公司；BALB/C 裸鼠購自中國科學院上海實驗動物中心；COX-2抑制劑塞來昔布購自美國輝瑞公司；細胞培養(yǎng)液購自美國Gibco公司；PCR引物由上海生物工程技術服務公司合成；凋亡試劑盒購自美國BD公司；抗COX-2單克隆抗體購買自美國圣克魯斯生物公司；羊抗鼠二抗購買自美國KPL公司；ECL化學發(fā)光試劑盒購買自美國Pierce公司。

1.2方法 （1）病例收集：收集本院2009年1月至2014年1月行膽管癌根治術標本24例。所有標本經病理診斷證實均為膽管癌，并取相應癌旁組織作為陰性對照組。所有患者均簽署手術同意書和病情告知書。（2）細胞培養(yǎng)： QBC939細胞和HIBEpiC細胞用含10%胎牛血清和1%青、鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中。采用0.25%胰酶消化傳代。（3）western blot實驗：采用western blot方法檢測COX-2蛋白表達。首先提取細胞漿蛋白，取30μg蛋白樣品陸續(xù)完成變性、電泳、轉膜（0.2μmPVDF膜）、封閉、一抗孵育（1μg/ml）、二抗孵育（0.2～0.5μg/ ml）、ECL發(fā)光、顯影、定影等步驟。β-actin 蛋白作為內參照。（4）動物模型試驗：21只雄性、年齡4周裸鼠飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境下。將2×106個細胞注射于裸鼠的腋下。在接種2周后，可見米粒狀腫塊，成瘤率達90.5%（19/21）。分別予以高濃度塞來昔布［（50 mg/（kg·d）］、低濃度塞來昔布［（10mg/（kg·d）］進行灌胃。隔天灌胃，2次/d，連續(xù)灌胃28d。空白對照組采用等量等濃度生理鹽水灌胃。每周測量腫瘤體積V=L×W2/2（cm3）。第28天處死裸鼠，摘除荷瘤稱重（g）。（5）WST-1法檢測QBC939細胞存活率：取對數生長期 QBC939細胞接種于96孔板中，每孔細胞數目約為104，然后讓細胞貼壁過夜。在加入不同濃度塞來昔布（5、10、20、40、80μmol/L）處理72h后，各組細胞加入WST-1試劑，在37℃下孵育2h，然后采用酶標儀檢測在450nm波長下的光密度值（OD）。細胞存活率=（實驗組OD值/對照組OD值）×100%。（6）Annexin V-FITC雙染法檢測QBC939細胞凋亡：通過WST-1試驗計算出塞來昔布的IC50值為29.97μmol/L，因而在本實驗中采用該濃度進行凋亡檢測。取對數生長期QBC939細胞進行試驗，在加入塞來昔布處理72h后，收集細胞≥1×105個，PBS沖洗后，分別先后加入FITC-Annexin V和PI染色液，在避光條件下孵育。然后上流式細胞儀進行檢測。

1.3統計學分析 采用SPSS17.0統計軟件。所有數據均以表示。在三組數據組間比較時采用方差分析，兩組數據組間比較時采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1COX-2在膽管癌組織和細胞中的表達COX-2蛋白在癌組織和癌旁組織中均有表達，其中COX-2蛋白在20例膽管癌標本中的表達水平顯著高于相應正常組織（P＜0.05）（圖1A）。COX-2蛋白在QBC939細胞中的表達水平亦顯著高于HIBEpiC細胞（圖1B）。

圖1　COX-2蛋白在膽管癌組織和細胞株中的表達

2.2塞來昔布抑制QBC939細胞生長 不同濃度塞來昔布作用72h后，QBC939細胞生長受到不同程度的抑制。該抑制作用具有濃度依賴性，表現為藥物濃度越高對QBC939細胞生長抑制作用越強（P＜0.05）（圖2）。計算得出半數抑制濃度（IC50值）為29.97μmol/L。

2.3塞來昔布抑制裸鼠荷瘤生長 采用塞來昔布灌胃后，在同一時間點裸鼠荷瘤體積顯著小于對照組，而高濃度藥物灌胃組荷瘤體積顯著低于低濃度藥物灌胃組（圖3A）。在藥物處理28d后，高濃度藥物灌胃組裸鼠荷瘤重量最小，低濃度藥物灌胃組裸鼠荷瘤重量次之，生理鹽水灌胃組裸鼠荷瘤重量最大（圖3B）。

2.4塞來昔布誘導QBC939細胞凋亡 塞來昔布作用72h后，QBC939細胞的凋亡比例顯著增高，說明塞來昔布能夠誘導QBC939細胞發(fā)生凋亡。見圖4。

3　討論

以腫瘤生長發(fā)展相關分子作為治療靶點的分子靶向治療越來越受到重視。近年來許多研究發(fā)現COX-2蛋白在多種消化道實體惡性腫瘤中如肝癌［4］、胃癌［5］、結腸癌［6］以及胰腺癌［7］中均存在表達異常升高的現象，且其高表達參與這些惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的多個環(huán)節(jié)。

圖2　塞來昔布抑制QBC939細胞生長

圖3　塞來昔布抑制裸鼠荷瘤生長

圖4　塞來昔布誘導QBC939細胞凋亡

COX-2蛋白在多數正常組織中表達微弱甚至缺失［8］，當正常組織發(fā)生惡變時COX-2表達可受腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中所產生的多種異常蛋白誘導而增高，例如炎性因子白介素-1［9］和白介素-8［10］、核因子KB （NF-KB）［11］，低氧誘導因子1α（HIF-1α）［12］等。在本研究中，作者發(fā)現COX-2在膽管癌組織中表達異常升高，而在膽管正常上皮細胞中表達微弱，這與其他的研究發(fā)現基本相符。以上結果說明COX-2異常升高可能在膽管癌的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用，也提示COX-2可能成為膽管癌治療中的靶點。于是，作者在體內和體外研究中采用COX-2選擇性抑制劑塞來昔布作用于COX-2高表達的QBC939細胞，并觀察該細胞的生長和凋亡情況。

本資料顯示塞來昔布在體內和體外均對膽管癌細胞的生長具有顯著抑制作用，且這種抑制作用具有明顯的濃度依賴性。通過計算得出塞來昔布對膽管癌細胞的IC50值約為29.97μmol/L。因此，在后續(xù)凋亡檢測試驗中選用該濃度。另外塞來昔布能夠誘導膽管癌細胞發(fā)生顯著凋亡。細胞凋亡是一種由機體主動調節(jié)、基因控制的程序性細胞死亡。凋亡根據信號途徑和參與基因不同，可分為內源性凋亡途徑和外源性凋亡途徑，而參與基因根據其在凋亡過程中的作用不同可分為凋亡誘導基因和凋亡抑制基因，前者包括Fas，p53，bax等，后者包括bcl-2，bcl-xl等。研究發(fā)現，COX-2抑制劑能夠促進凋亡誘導基因的表達，同時降低凋亡抑制基因的表達，最終導致凋亡［13，14］。這可能是塞來昔布導致QBC939細胞凋亡的原因。在本研究中未探討具體分子機制，有待于后續(xù)研究。

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Objective To evaluate the effects of Celecoxib，a selective cyclooxygenase-2 inhibitor，on the proliferation and apoptosis of QBC939 cells. Methods The expression of COX-2 in the tissue samples，QBC939 cells and HIBEpiC cells was examined using western blot assay. The in vitro inhibitory effects of Celecoxib on the proliferation of QBC939 cells were tested using WST-1 assay. The in vivo inhibitory effects of Celecoxib on the proliferation of QBC939 cells were evaluated on animal xenograft tumor models. In addition，the effects of Celecoxib on apoptosis of QBC939 cells were evaluated using Annexin V-FITC assay. Results The level of COX-2 expression in cholangiocarcinoma tissues was signifi cantly higher than that in normal tissues and its expression in QBC939 cells was also signifi cantly higher than that in HIBEpiC cells. Celecoxib signifi cantly inhibited the proliferation of QBC939 cells in vitro and in vivo. In addition，Celecoxib induced apoptosis of QBC939 cells signifi cantly. Conclusion Celecoxib can induce signifi cant apoptosis on QBC939 cells which may lead to growth inhibition of QBC939 cells in vitro and in vivo.

Cholangiocarcinoma Cyclooxygenase-2 inhibitor Apoptosis

530021 廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院介入治療科