羥乙基淀粉復(fù)合烏司他丁對(duì)保護(hù)重度休克大鼠腸通透性作用的研究

李寶永　蒲國(guó)華　許景偉

羥乙基淀粉復(fù)合烏司他丁對(duì)保護(hù)重度休克大鼠腸通透性作用的研究

李寶永蒲國(guó)華許景偉

目的 探究烏司他丁、羥乙基淀粉對(duì)保護(hù)腸黏膜控制內(nèi)毒素（ET）通過(guò)通透性增強(qiáng)的腸壁進(jìn)入循環(huán)血液的作用。方法 健康雄性大鼠85只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（Ⅰ組，n=5）、重度休克組（Ⅱ組，n=40）、羥乙基淀粉烏司他丁干預(yù)重度休克復(fù)蘇組（Ⅲ組，n=40），后兩組又分為5個(gè)時(shí)相點(diǎn)，即1h、2h、4h、8h、16h，各時(shí)間點(diǎn)8只大鼠。采用比色法檢測(cè)二胺氧化酶（DAO）表達(dá)變化。采用光度法檢測(cè)ET表達(dá)變化。結(jié)果 Ⅲ組從復(fù)蘇開(kāi)始DAO含量即較Ⅱ組低近1倍，而且8hⅡ組達(dá)到了最高峰，而Ⅲ組卻急速下降。兩組比較差異有顯著性（P＜0.01）。各組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Ⅲ組的血清ET于1h時(shí)雖然較正常含量仍高出34倍之多，但較Ⅱ組要低近1倍，至16h時(shí)幾乎接近了正常含量，兩組比較差異有顯著性（P＜0.01）。各組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)之間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 ET、DAO含量測(cè)定是判斷小腸通透性改變的敏感性指標(biāo)。羥乙基淀粉烏司它丁對(duì)于降低重度創(chuàng)傷-失血性休克后大鼠血中ET、DAO含量具有顯著性效果。

重度休克 二胺氧化酶 內(nèi)毒素 羥乙基淀粉 烏司它丁

大量研究表明，內(nèi)毒素（ET）血癥對(duì)重度創(chuàng)傷患者的轉(zhuǎn)歸起著重要的作用［1～3］。作者自2013年2月至2014年8月根據(jù)應(yīng)用羥乙基淀粉及烏司它丁復(fù)蘇后，通過(guò)測(cè)定不同時(shí)間窗大鼠血清二胺氧化酶（DAO）［4］、ET水平，以探究羥乙基淀粉及烏司它丁復(fù)蘇對(duì)保護(hù)腸黏膜、控制ET通過(guò)通透性增強(qiáng)的腸壁進(jìn)入循環(huán)血液的作用［5～7］。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物選擇及分組 雄性SD大鼠85只（SPF級(jí)），體重（300±20）g，飼養(yǎng)5d，12h光/黑循環(huán)。實(shí)驗(yàn)大鼠分為3組：正常對(duì)照組（Ⅰ組，只=5）、重度休克組（Ⅱ組，只=40）、羥乙基淀粉烏司它丁干預(yù)重度休克復(fù)蘇組（Ⅲ組，只=40）。Ⅰ組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別稱重，由下腔靜脈抽取血液3ml進(jìn)行DAO、ET檢測(cè)。Ⅱ組為重度休克組（只=40）：于1h、2h、4h、8h、16h不同時(shí)間窗由下腔靜脈抽取血液3ml進(jìn)行DAO、ET檢測(cè)。Ⅲ組經(jīng)股靜脈輸注羥乙基淀粉（0.02ml/g）烏司它丁（6U/g），然后在休克模型成功復(fù)制并穩(wěn)定30min后1h、2h、4h、8h、16h不同時(shí)間窗，于下腔靜脈抽取血液3ml，進(jìn)行DAO和ET檢測(cè)，每一亞組實(shí)驗(yàn)大鼠為8只，共40只。

1.2主要儀器及試劑 ET測(cè)定儀，BL-410生物機(jī)能試驗(yàn)系統(tǒng)，手術(shù)器械，分析天平，酶標(biāo)儀，ET酶聯(lián)免疫分析試劑盒，DAO酶聯(lián)免疫分析試劑盒，羥乙基淀粉，烏司它丁。

1.3休克模型的復(fù)制 按照重度創(chuàng)傷-失血性休克大鼠模型標(biāo)準(zhǔn)［8］，取SD大鼠稱重后，以10%水合氯醛（0.3ml/100mg）腹腔注射麻醉，固定并消毒。（1）分離一側(cè)頸內(nèi)動(dòng)、靜脈，行動(dòng)靜脈置管。頸動(dòng)脈導(dǎo)管與BL-410生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)相連，監(jiān)測(cè)MAP。（2）分離右股動(dòng)脈并插管，用于放血。（3）游離右側(cè)股骨，咬碎股骨干后縫合。（4）經(jīng)致內(nèi)靜脈導(dǎo)管注入肝素（1250U/kg）使全身肝素化后經(jīng)股動(dòng)脈導(dǎo)管緩慢放血，在10min內(nèi)使MAP降至（35±5）mmHg，完成模型的復(fù)制。

1.4血清的采集及存放 常規(guī)消毒打開(kāi)大鼠腹腔，顯露下腔靜脈及門靜脈，分別留取靜脈血3ml，4℃過(guò)夜，3000r/min，低溫離心10min，取血清各0.3ml，分裝EP管中置于-70℃冰箱保存?zhèn)溆茫y(cè)DAO和ET）。

1.5ET的檢測(cè) 用ET專用采血瓶加入1ml靜脈全血，離心（1500r/min，10min），然后取0.2ml血漿加入稀釋液瓶中（內(nèi)含0.8ml稀釋液），75℃水浴加熱10min備用。在上機(jī)專用試管中加入0.1ml鱟試劑，再加入1ml已處理的備用液，使試管內(nèi)溶液混勻，然后把各試管按編號(hào)逐次插入檢測(cè)儀反應(yīng)孔中，自動(dòng)處理數(shù)據(jù)。

1.6DAO的檢測(cè) （1）將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫。（2）標(biāo)本用標(biāo)本稀釋液1：1稀釋后加入50μl于反應(yīng)孔內(nèi)。（3）加入稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品50μl于反應(yīng)孔、加入待測(cè)樣品50μl于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50μl的生物素標(biāo)記的抗體。緩慢振蕩混勻，37℃溫育1h。（4）甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30s，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)3次。（5）每孔加入80μl的親和鏈酶素（HRP），緩慢振蕩混勻，37℃溫育30min。（6）甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30s，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)3次。（7）每孔加入底物A、B各50μl，緩慢振蕩混勻，37℃溫育10min。避免光照。（8）取出酶標(biāo)板，迅速加入50μl終止液，加入終止液后應(yīng)立即測(cè)定結(jié)果。（9）在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。計(jì)算：以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為縱坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)），OD值為橫坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)），在對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（x±s）表示，采用單因素方差分析，各組數(shù)據(jù)均作正態(tài)性檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1血清DAO檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)表1。

表1　血清DAO檢測(cè)結(jié)果［U/L，（x±s）］

2.2血清ET檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)表2。

表2　血清ET檢測(cè)結(jié)果［pg/ml，（x±s）］

3　討論

創(chuàng)傷-失血性休克是臨床上常見(jiàn)的危重癥之一。機(jī)體在發(fā)生創(chuàng)傷-失血性休克的發(fā)展過(guò)程中，腸道起著重要的作用［9，10］。腸道被認(rèn)為是最大的革蘭陰性桿菌ET池。生理解剖的特點(diǎn)決定了腸黏膜以及小腸絨毛是胃腸道缺血缺氧最敏感部位［11，12］，而且亦是恢復(fù)最晚的器官。休克發(fā)生后，胃腸道出現(xiàn)缺血［13～15］，其最早的表現(xiàn)即為腸道通透性增高，從而導(dǎo)致ET經(jīng)腸黏膜吸收的增多。

DAO是人類和所有哺乳動(dòng)物腸黏膜上皮絨毛細(xì)胞胞漿中具有高度活性的細(xì)胞內(nèi)酶，在外周血中活性穩(wěn)定，是反映腸黏膜上皮細(xì)胞成熟度和完整性的相對(duì)穩(wěn)定的血漿標(biāo)記物。其對(duì)腸黏膜損傷引起腸道通透性的增加早期診斷敏感而且特異性強(qiáng)。

ET是革蘭陰性（G-）桿菌外膜的重要組成部分，正常腸道中，細(xì)菌在復(fù)制過(guò)程中外膜碎片不斷脫落，使腸內(nèi)游離ET處于高水平，即使有少量的細(xì)菌、毒素通過(guò)了腸道屏障，也會(huì)被腸道的淋巴組織，脾臟、肝臟的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)所清除，不會(huì)對(duì)機(jī)體造成損害。當(dāng)發(fā)生休克時(shí)，各臟器血流灌注不足導(dǎo)致缺血，腸道亦不例外，從而導(dǎo)致腸道屏障功能損傷，腸黏膜通透性增加，使細(xì)菌、ET透過(guò)腸道屏障移位入血；同時(shí)，發(fā)生休克時(shí)腸黏膜的免疫功能受損，機(jī)體不能有效地清除侵入的致病菌，亦是促使細(xì)菌、ET易侵入血的一個(gè)重要原因。本實(shí)驗(yàn)顯示Ⅱ組的血清ET隨著時(shí)間的推移在逐漸增加，較正常含量高出50余倍。而Ⅲ組的血清ET于1h時(shí)雖然較正常含量仍高出34倍之多，但較Ⅱ組要低近1倍，至16h時(shí)幾乎接近了正常含量。兩組比較差異有顯著性（P＜0.01）。各組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

綜上所述，ET、DAO含量測(cè)定是判斷小腸通透性改變的敏感性指標(biāo)。休克遷延時(shí)間越長(zhǎng)，血中ET、DAO含量越高。羥乙基淀粉烏司他丁對(duì)于降低重度創(chuàng)傷-失血性休克后大鼠血中ET、DAO含量具有顯著性效果。

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Objective To explore the effect of ulinastatin，hydroxyethyl starch on the protection of intestinal mucosal permeability.Methods Choose healthy male SD rats - 85 only normal control Group（divided into two groups at random，Ⅰ- Group，n=5），severe shock Group（Group～Ⅱ，n=40），Hydroxyethyl Starch and ΜLinastain for injection intervention severe shock to recovery Group（Group～Ⅲ，n=40），hind two groups and divided into fi ve time phase point，namely 1h，2h，4h，8h，16h，each time points，eight rats. Results Group III from recovery to begin DAO levels than group II nearly 1 times lower，and 8h II group reached its peak，and group III was falling rapidly. There was a signifi cant difference between the two groups（P＜0.01）. Between different time points in each group，the difference was statistically signifi cant（P＜0.05）. The serum ET III group in 1H was normal in content is still as much as 34 times higher than in group II，but lower than the nearly 1 times，to 16h is close to a normal content. There was a signifi cant difference between the two groups（P＜0.01）. Between different time points in each group，the difference was statistically signifi cant（P＜0.05）. Conclusion Determination of the content of ET，DAO is to determine the sensitivity of intestinal permeability change index. The effects of hydroxyethyl starch it Ding to reduce severe traumatic hemorrhagic shock ET，DAO content in the blood of the rats after signifi cant effect.

2 amine oxidase Endotoxin Hydroxyethyl Starch ΜLinastain for Injection

063000 河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院