蜂王漿對雌性大鼠生長發育的影響

沈 芳，劉振國，沈 杰，吉 挺*

（揚州大學動物科學與技術學院，江蘇 揚州 225009）

蜂王漿對雌性大鼠生長發育的影響

沈 芳，劉振國，沈 杰，吉 挺*

（揚州大學動物科學與技術學院，江蘇 揚州 225009）

目的：探討高劑量蜂王漿對雌性大鼠生長發育的影響。方法：實驗組大鼠按3 g/（200 g·d）（以體質量計，下同）灌胃新鮮的蜂王漿溶液，對照組按3 mL/（200 g·d）灌胃生理鹽水，4 周后，停止灌胃，繼續飼養2 周。每兩周解剖一批大鼠，稱質量計算心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、子宮、卵巢臟器系數，用放射免疫技術檢測血清雌二醇（estradiol，E2）、促卵泡素（follicle stimulating hormone，FSH）、促黃體素（luteinizing hormone，LH）、孕激素（progestrone，P）含量，實時定量聚合酶鏈式反應（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）檢測卵巢和子宮中雌激素受體α（estrogen receptor α，ERα）、雌激素受體β（estrogen receptor β，ERβ）、促卵泡素受體（follicle stimulating hormone receptor，FSHR）、促黃體素受體（luteinizing hormone recepter，LHR）、孕激素受體（progestrone receptor，PR）mRNA表達量。結果：灌胃2 周，實驗組大鼠體質量、主要臟器系數、血清主要性激素含量及其卵巢和子宮中受體表達量與對照組相比均無顯著差異；灌胃4 周，實驗組大鼠體質量顯著低于對照組，實驗組血清E2顯著高于對照組，實驗組卵巢PR mRNA表達量顯著高于對照組，實驗組子宮中ERα、ERβ、PR mRNA表達量顯著高于對照組。實驗組與對照組臟器系數無顯著差異；停止灌胃2 周后，實驗組大鼠體質量、主要臟器系數、血清主要性激素含量與對照組相比均無顯著差異，實驗組卵巢中FSHR、ERβ、PR mRNA表達量顯著高于對照組，實驗組子宮中ERα、ERβ、FSHR和PR mRNA表達量顯著高于對照組。結論：高劑量的蜂王漿在一定程度上影響雌性大鼠的生長發育。

蜂王漿；臟器系數；激素；激素受體

蜂王漿又稱蜂皇漿、王漿、蜂乳，是10～15 日齡哺育工蜂舌腺和上顎腺分泌的呈乳白色或淡黃色的漿狀物，有酸、澀、辛辣、甜并略帶芳香氣味［1］。蜂王漿中的營養保健和藥理成分豐富而均衡，具有抗氧化、抗輻射、抗疲勞、抗衰老、提高機體免疫力［2-4］、提高動物繁殖能力［5］及美容養顏［6］多種作用。

隨著人們對健康生活的追求不斷提高，人們對功能食品的研究越來越多。蜂王漿作為世界上少數可供人類直接食用且具有高活性成分的超級營養食品，日益受到人們的關注。很多國家已經將蜂王漿開發成商業產品尤其是作為營養食品、化妝品和藥品［6］。有蜂王漿激素檢測的結果表明，蜂王漿中的激素是痕量的，并且遠低于牛羊肉和雞蛋中的激素含量［8-9］。同時，大量研究表明蜂王漿和女性乳腺癌沒有關系［10-12］，目前尚未發現蜂王漿會引起女性疾病或者兒童性早熟的報道。然而，激素替代療法與乳腺癌的相關性存在爭議，甚至還有人將服用蜂王漿和激素替代療法混為一談［7］；Katayama等［13］發現部分女性在食用蜂王漿后引起過敏反應；Yang Anshu等［14］的研究顯示大鼠灌胃蜂王漿劑量為800 mg/kg時，大鼠精子畸形率增加；實踐中發現部分年輕女性口服蜂王漿后會發生不良反應，以致“蜂王漿會引發乳腺癌”的傳言造成消費者的疑慮和擔心，同時引起人們對蜂王漿激素效應的極大關注。

本研究以青春期的雌性大鼠為對象，研究高劑量的蜂王漿對青春期雌性大鼠生長發育的影響，血清中雌二醇（estradiol，E2）、促卵泡素（follicle stimulating hormone ，FSH）、促黃體素（luteinizing hormone，LH）、孕激素（progestrone，P）以及卵巢和子宮中雌激素受體α（estrogen receptor α，ERα）、ERβ、促卵泡素受體（follicle stimulating hormone receptor，FSHR）、促黃體素受體（luteinizing hormone recepter，LHR）、孕激素受體（progestrone receptor，PR）mRNA表達的影響，為蜂王漿的應用提供基礎數據。

1　材料與方法

1.1動物、材料與試劑

48 只8 周齡健康SPF級雌性大鼠，體質量（182±5）g，由揚州大學比較醫學中心提供，合格證號：SCXK（蘇）2012-1101。

新鮮蜂王漿由揚州大學實驗蜂場提供。

E2、FSH、LH、P放射免疫試劑盒 北京北方生物科技研究所；焦磷酸二乙酯 美國Amersco公司；Trizol試劑 美國Invitrogen公司；反轉錄熒光定量聚合酶鏈式反應試劑盒 大連寶生物工程有限公司。

1.2儀器與設備

r-911全自動放免計數儀 中國科技大學實業總公司；ABI System 7500型PCR儀 美國ABI公司；NanoDrop 1000型分光光度計 美國Thermo公司。

1.3方法

1.3.1動物分組和飼養

48 只8 周齡雌性大鼠隨機分為兩組，分別為對照組和實驗組，按每籠4～5 只飼養于揚州大學比較醫學中心開放的環境中，大鼠自由采食、飲水。

實驗組大鼠按3 g/（200 g·d）（以體質量計，下同）灌胃新鮮的蜂王漿溶液，預實驗表明低劑量的蜂王漿對雌性大鼠沒有顯著影響，因此，本實驗給予大鼠灌胃高劑量蜂王漿，為3 g/（200 g·d），根據黃娟萍等［15］的換算法換算成人體用量為143 g/（60 kg·d），遠高于揚州大學蜂王漿3～5 g/（60 kg·d）的推薦用量。對照組按3 mL/（200 g·d）灌胃生理鹽水。每周稱體質量。灌胃4 周后，停止灌胃，繼續飼養2 周。

1.3.2血清性激素和臟器系數測定

分別于大鼠灌胃第15天、第29天和停止灌胃后第15天，每組隨機取8 只大鼠稱質量后，麻醉，動脈取血，4 000 r/min離心10 min獲得血清，測定血清中E2、FSH、LH和P的含量，采血后處死大鼠，迅速取子宮和卵巢稱質量后于液氮中速凍，再轉入-70 ℃冰箱中保存。同時分離心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟，剔除組織黏附的脂肪和筋膜，濾紙吸干后稱質量，按照下式計算各器官的臟器系數。

1.3.3子宮和卵巢激素受體基因mRNA的表達檢測

用Trizol提取子宮和卵巢組織的總RNA。引物序列見表1，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。Real-time PCR按TaKaRa說明書操作。

表1　引物序列Table1 Primer sequenceess

1.4數據處理與統計分析

采用SPSS 13.0軟件非配對t檢驗對實驗結果進行分析。

2　結果與分析

2.1蜂王漿對大鼠體質量的影響

圖1　大鼠每周的體質量Fig.1 Body weight of rats exposed to royal jelly for different weeks

由圖1可知，大鼠初始體質量差異不顯著，灌胃4 周內實驗組體質量持續低于對照組，在灌胃到第3、4周時，實驗組體質量顯著低于對照組（P＜0.05）；停止灌胃后（5～6 周），實驗組體質量增長速率明顯增加，停止灌胃1周（第5周）后，實驗組體質量和對照組體質量無顯著差異（P＞0.05）。結果表明灌胃高劑量蜂王漿會影響大鼠體質量的增加。

2.2蜂王漿對大鼠臟器系數的影響

表2　大鼠的臟器系數Table2 Organ coefficients in female rats orally given royal jelly

由表2可知，對灌胃2 周、4 周和停止灌胃2 周后的大鼠各主要臟器的臟器系數比較，實驗組和對照組差異不顯著（P＞0.05）。表明高劑量蜂王漿對大鼠臟器系數沒有顯著影響。

2.3蜂王漿對雌性大鼠血清主要性激素水平的影響

表3　蜂王漿對雌性大鼠血清主要性激素水平的影響Table3 Influence of royal jelly on serum levels of sex hormones in female rats rats

由表3可知，灌胃蜂王漿2 周時，實驗組和對照組大鼠血清主要性激素差異不顯著（P＞0.05）；灌胃蜂王漿4 周時，實驗組大鼠血清中E2含量顯著高于對照組（P＜0.05），其他性激素含量實驗組和對照組差異不顯著；停止灌胃2 周后，實驗組大鼠血清中主要性激素含量和對照組差異不顯著。表明灌胃高劑量蜂王漿4 周可以顯著提高雌性大鼠血清E2的含量。

2.4卵巢和子宮中主要性激素受體基因的相對表達量

2.4.1卵巢中性激素受體基因相對表達量

圖2　卵巢中性激素受體基因相對表達量Fig.2 mRNA expression levels of ERα， ERβ， FSHR， LHR， and PR in the ovary

由圖2可知，大鼠灌胃2 周時，各主要性激素受體的表達量和對照組相比沒有顯著差異（P＞0.05）；灌胃4 周，PR mRNA表達量顯著高于對照組（P＜0.05），其他激素受體基因表達量和對照組無顯著差異；停止灌胃2 周，大鼠卵巢主要性激素受體基因的表達量整體高于對照組，尤其是ERβ、FSHR和PR mRNA表達量顯著高于對照組（P＜0.05）。表明高劑量蜂王漿對雌性大鼠卵巢主要性激素受體的表達量存在一定的影響。

2.4.2子宮中性激素受體基因相對表達量

圖3　子宮中性激素受體基因相對表達量Fig.3 mRNA expression levels of ERα， ERβ， FSHR， LHR， and PR in the uterus

由圖3可知，大鼠灌胃2 周時，實驗組主要性激素受體基因的表達量和對照組相比沒有顯著差異（P＞0.05）；灌胃4 周，ERα、ERβ、PR mRNA的表達量顯著高于對照組（P＜0.05），LHR、FSHR mRNA表達量和對照組無顯著差異；停止灌胃2 周，實驗組ERα、ERβ、FSHR、PR mRNA表達量顯著高于對照組（P＜0.05），LHR mRNA表達量差異不顯著（P＞0.05）。表明高劑量的蜂王漿對雌性大鼠子宮主要性激素受體表達量有一定影響。

3　結論與討論

眾多研究結果表明，低劑量蜂王漿對動物生長是有利的［16-17］，并且可以顯著提高動物的繁殖性能［18-20］，然而實踐中人們對蜂王漿的顧慮依然不容忽視。雖然眾多報道表明蜂王漿不會引起性早熟［21］，不會增加女性患乳腺癌以及腫瘤的危險［22］，但并沒有消除大眾對蜂王漿的顧慮。為進一步研究蜂王漿對人體的影響，本研究采用高劑量蜂王漿飼喂大鼠，并對大鼠體質量、臟器系數、血清性激素含量及其受體基因在卵巢和子宮中的相對表達量進行檢測。

灌胃到第3、4周時實驗組大鼠體質量顯著低于對照組，可能是由于脂肪沉積減少，這與周明等［23］的研究結果一致。臟器系數是評價藥物毒理性的基本參數，本實驗中蜂王漿對大鼠的臟器系數無顯著影響，表明該劑量蜂王漿沒有毒性，這與前人得出的蜂王漿是安全的及對人體沒有毒害作用的認識是一致的［8］。灌胃4 周，大鼠血清各激素只有E2顯著升高，停止灌胃2 周后，血清中各激素含量恢復正常，表明持續灌胃蜂王漿對大鼠造成的影響不大，并且停止灌胃后便可以恢復正常。

雌性大鼠生殖功能的內分泌調節主要通過下丘腦-垂體-性腺軸來調控，即下丘腦通過分泌促性腺激素釋放激素來調節垂體促性腺激素的分泌，促性腺激素再通過外周血液循環作用于性腺，進一步促進性腺分泌性激素，性激素和性器官上的受體結合來調控雌性動物的發育。大鼠灌胃蜂王漿4 周后，E2水平顯著高于對照組，停止灌胃2 周后大鼠體內主要性激素水平恢復正常，表明蜂王漿可以提高大鼠體內雌二醇水平，停止蜂王漿刺激后雌二醇水平恢復正常，這一發現可為治療女性體內雌激素水平偏低提供參考。

激素活性是通過受體介導的，但是激素受體功能的發揮受多種因素調節，包括協同調節因子、蛋白翻譯后修飾，受體基因轉錄水平等。本研究中灌胃蜂王漿提高子宮和卵巢中FSHR和PR mRNA表達量，但是血清中FSH和P水平并沒有顯著變化，這可能是蜂王漿中的活性物質直接抑制了調節因子的活性或者蛋白翻譯后的修飾過程，具體作用機制尚需進一步研究［18］。雌激素的生理作用主要由ERα和ERβ兩種受體亞型介導。雌激素兩種受體的表達具有組織和細胞特異性，雌二醇在此過程對兩種受體有不同的調節作用［24］。本實驗中灌胃高劑量的蜂王漿大鼠卵巢中ERα以及子宮中ERα和ERβ mRNA表達量顯著增加，一方面可能是由于血清雌二醇水平增加加強了雌激素受體的活化，另一方面也可能是蜂王漿中的活性物質直接作用于不依賴于雌激素受體活化的磷酸化過程，有研究表明存在一些信號通路可以不通過激素而激活雌激素受體［25］，具體引起本實驗中雌激素受體表達量顯著增加的分子機制仍需進一步研究。停止灌胃2 周后卵巢和子宮中主要性激素受體的表達量仍顯著高于對照組，這可能與蜂王漿發揮作用的延遲有關，具體機制還需要進一步研究。

雌激素是維持女性生理最重要的激素，廣泛參與體內物質及能量的代謝。雌性進入青春期后由卵巢分泌進入血液與性激素結合蛋白和白蛋白可逆性結合，擴散到靶組織發揮生理作用［26］。實驗中高劑量的蜂王漿活化了雌激素受體基因的表達，促進血清中雌激素含量的增加。血清雌激素含量增加可能是大鼠體質量減輕的主要因素，這與前人的研究雌激素與動物肥胖有關是一致的［27-28］。同時，前人的研究結果表明雌激素及其受體的過表達與乳腺癌、子宮內膜炎和卵巢癌的發生有關［29-31］，而本研究中血清中E2含量的增加以及雌激素受體和孕激素受體表達量增加可能是實踐中蜂王漿引起部分女性發生子宮等性器官病變的原因。雖然蜂王漿中雌激素是痕量的，但是年輕女性本身體內雌激素分泌較旺盛，因此建議年輕女性慎重食用。

目前，關于低劑量蜂王漿對動物有益作用的研究較多［17-19］，但關于高劑量蜂王漿對雌性哺乳動物的研究較少。本實驗針對高劑量蜂王漿對雌性大鼠生長發育影響進行研究，結果表明，持續灌胃高劑量的蜂王漿會抑制大鼠體質量的增加，對大鼠臟器系數沒有影響，促使大鼠血清中E2的水平上升；停止灌胃2 周后，卵巢和子宮中ERβ、FSHR、PR以及子宮中ERα mRNA的表達量顯著升高。這些作用結果的具體機制以及是由蜂王漿中的哪種特定物質引起的還不清楚，后續的研究將深入探討蜂王漿中特定物質對大鼠生長發育的具體機制，為更合理有效地利用蜂王漿提供理論依據。

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Effect of Royal Jelly on Growth and Development of Female Rats

SHEN Fang， LIU Zhenguo， SHEN Jie， JI Ting*
（College of Animal Science and Technology， Yangzhou University， Yangzhou 225009， China）

Objective： To investigate the effect of high dose of royal jelly on the growth and development of female rats. Methods： The rats were given by gavage fresh royal jelly in the experimental group at a dose of 3 g/（200 g·d） body weight（BW）， while the rats in the control group was administered by gavage with normal saline at a dose of 3 mL/（200 g·d）BW. After 4 weeks of administration， the rats were continuously fed for additional 2 weeks. Eight rats from each group were anatomized every two weeks. The visceral indexes of heart， liver， spleen， lung， kidney and adrenal grand were examined. Serum estradiol （estradiol， E2）， follicle stimulating hormone （FSH）， luteinizing hormone （LH） and progesterone（progesterone， P） was detected with radioimmunoassay. Real-time PCR was used to detect the expression levels of estrogen receptor alpha （ERα）， estrogen receptor beta （ERβ）， follicle stimulating hormone receptor （FSHR）， luteinizing hormone receptor （LHR） and progesterone receptor （PR）. The results showed that there was no signifi cant difference between the experiment and control groups after 2 weeks of administration， but a signifi cant difference was found after 4 weeks. Body weight in the experiment group was signifi cantly lower than in the control group， E2 level was signifi cantly higher than in the control group， and the mRNA expression level of ovarian PR was higher than in the control group. The expression levels of ERα， ERβ and PR in uterus were signifi cantly higher than in the control group. At 2 weeks after administration， there was no signifi cant difference in body weight， organ coeffi cients or serum sex hormone levels between both groups. But the mRNA expression level of FSHR， ERβ and PR in the ovary were signifi cantly higher than those in the control group， and the expression levels of ERα， ERβ， FSHR and PR in the uterus were signifi cantly higher than those in the control group. In all， the growth and development of female rats were infl uenced by the gavage administration of high-dose royal jelly to some extent.

royal jelly； organ coeffi cient； hormone； hormone receptor

S896.3

A

1002-6630（2015）03-0202-05

10.7506/spkx1002-6630-201503039

2014-05-17

揚州大學服務蜂業專業合作社科技服務專項（SBE201230535）；國家現代農業（蜂）產業技術體系建設專項（CARS-45-SYZ6）

沈芳（1990—），女，碩士研究生，主要從事蜜蜂遺傳學研究。E-mail：shenshuanger@126.com

吉挺（1974—），男，副教授，博士，主要從事蜜蜂種質資源保護和利用研究。E-mail：tji@yzu.edu.cn