乳制品中高產雙乙酰乳酸菌的篩選及鑒定

田玉娟，周 康*，韓新鋒，劉書亮

（四川農業大學食品學院，四川 雅安 625014）

乳制品中高產雙乙酰乳酸菌的篩選及鑒定

田玉娟，周 康*，韓新鋒，劉書亮

（四川農業大學食品學院，四川 雅安 625014）

以四川省生鮮乳和發酵乳為原料，利用MRS培養基進行分離篩選，共分離出39 株乳酸菌，對其中37 株進行產雙乙酰的初篩，分離出7 株產量較高的菌株，最后從這7 株中確定出1 株產雙乙酰量最高的乳酸菌YJ-110，通過分光光度計法測得該菌株雙乙酰的產量為23.826 mg/L。經形態學、生理生化特性和16S rDNA分子鑒定，確定該菌為嗜檸檬酸明串珠菌（Leuconostoc citreum）。

雙乙酰；分離鑒定；明串珠菌

近幾年，隨著酸奶產量的逐年遞增，影響人們選擇酸奶的因素不僅僅是其功能性，另一個重要因素就是它的風味。酸奶的風味來源于乳酸和羰基化合物，其中雙乙酰是構成酸奶風味的主要成分，因此酸奶中雙乙酰的含量檢測對酸奶風味評價尤為重要［1-2］。雙乙酰，又名丁二酮、二乙酰，經稀釋后呈強烈的奶油香氣，是乳制品中一種重要的風味物質，主要用于配制奶制品香精（黃油、乳酪、牛奶、酸乳酪）和香草、巧克力、糖果、堅果、咖啡以及水果等香精［3-5］。目前乳品中雙乙酰含量的測定方法主要有紫外分光光度計比色法、氣相色譜法等［6-8］。鄰苯二胺比色法由于其方法簡單容易操作，儀器設備簡易，適宜在實驗室推廣等特點而得到普遍應用。但目前國內雙乙酰的生產工藝主要是采用亞硝化法，但該工藝在制備過程產生大量硫酸氫鈉，難以回收，且亞硝酸類物質毒性大、沸點低，對環境危害嚴重［9-10］。隨著人們生活水平的提高，以及對食品安全的關注度不斷提升，其使用效果和安全性已經不能滿足消費者和食品香精香料行業的發展需求。因而，國內外的研究重點轉向了采用崇尚自然、回歸自然的微生物發酵法來制備雙乙酰［11-12］。

本實驗從四川省本地生鮮乳和發酵乳中分離篩選高產雙乙酰的乳酸菌菌株，通過生理生化特性和16S rDNA鑒定其屬種，并用紫外分光光度計比色法測得其含量。以期為解決以化學合成生產雙乙酰帶來的環境污染等一系列的問題奠定理論基礎，為滿足食品行業對天然雙乙酰等風味物質的需求提出發展方向。

1　材料與方法

1.1菌種與試劑

菌種分離自四川本地的生鮮乳和發酵乳制品。選用乳酸菌培養基（MRS）作為微生物生長培養基（質量分數，下同）：葡萄糖2%、蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母膏0.5%、磷酸氫二鉀0.2%、乙酸鈉0.5%、檸檬酸氫二銨0.2%、硫酸鎂0.058%、硫酸錳0.025%、吐溫-80 0.1%，pH 6.5。含有12%脫脂乳粉的脫脂乳培養基。

聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）反應用Taq酶、Marker DL2000、Golden View、Loading Buffer和TIANGEN細菌基因組DNA提取試劑盒-離心柱型寶生物工程（大連）有限公司；雙乙酰溶液標準品、4 mol/L鹽酸、1%鄰苯二胺、16%三氯乙酸均為分析純。

PCR通用引物27F，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成：上游引物：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；下游引物：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’。

1.2方法

1.2.1乳酸菌的初篩

取生鮮乳和發酵乳樣品各25 mL，分別加入裝有225 mL無菌生理鹽水的無菌三角瓶中，充分振搖，進行10 倍梯度稀釋。分別取稀釋度為10-1、10-3、10-5、10-7的稀釋液1 mL傾注于添加了1.5% CaCO3的MRS固體培養基上，在37 ℃條件下培養48～72 h后，選取優勢菌落劃線分離。將分離純化后的乳酸菌菌株進行接觸酶實驗和革蘭氏染色。

1.2.2產雙乙酰菌株的復篩

標準曲線的制備：將12%的脫脂乳培養基121 ℃滅菌7 min后迅速冷卻，配制質量濃度為0、2.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0 mg/L的雙乙酰溶液［13］。取各質量濃度的標準液10 mL，加入同等體積16%三氯乙酸溶液，振蕩搖勻，靜置，取10 mL上清液均分入2 支試管中。1號管中加入0.5 mL 1%鄰苯二胺溶液，2號管作為對照，振搖后黑暗靜置30 min，分別加入4.0 mol/L HCl 溶液，1號管2.0 mL，2號管2.5 mL，終止反應。在335 nm波長處測定各質量濃度對應的OD335nm值。以雙乙酰質量濃度為橫坐標，OD335nm值為縱坐標繪制雙乙酰標準曲線［14］。

乳酸菌產雙乙酰含量的測定：將12%的脫脂乳培養基121 ℃滅菌7 min后迅速冷卻，接種2%乳酸菌菌懸液，37 ℃搖床培養24 h，取10 mL上清液，分兩支試管，每支5 mL，按上述方法測定各OD335nm值，根據標準曲線回歸方程計算出雙乙酰的含量。每次實驗做3 個平行取平均值，篩選出產雙乙酰較多的菌株。

1.2.3PCR擴增與16S rDNA的鑒定

用細菌基因組提取試劑盒提取乳酸菌的總DNA，并以此為模板，擴增其16S rDNA序列。25 μL擴增體系和擴增程序分別為：12.5 ?L 2×PCR Master Mix，1 ?L F-Nuc（10 μmol/L），1 ?L R-bla（10 μmol/L），1 ?L模板DNA，9.5 ?L ddH2O；94 ℃預變性5 min，94 ℃變性45 s、56 ℃退火45 s、72 ℃延伸1.5 min以上循環30 次，最后延伸72 ℃ 10 min。取PCR擴增產物及DL2000 Marker各5 μL，采用1%瓊脂糖凝膠（含Golden View）電泳方法檢測，電壓85 V，水平電泳50 min，用凝膠成像儀觀察、拍照。PCR產物經電泳檢測后，應在預計的分子質量，約1 500 bp 處出現單一DNA條帶，然后將圖像拍照保存。將PCR擴增產物寄至生工生物工程（上海）股份有限公司使用通用引物27F雙向測通。將取得的16S rDNA基因測序結果進行BLAST在線分析，進行同源性序列相似度比較，根據其同源性鑒定菌種。

1.2.4生理生化實驗鑒定

采用糖（醇）發酵實驗、H2O2酶實驗、產硫化氫實驗、精氨酸水解實驗對菌株進行鑒定。

2　結果與分析

2.1乳酸菌的篩選結果

2.1.1乳酸菌的初篩結果

挑取優勢菌落，分別劃線于添加1.5% CaCO3MRS培養基上進行分離純化，初步分離純化出菌株39 株，經過革蘭氏染色鏡檢，接觸酶反應，保存革蘭氏陽性，接觸酶陰性菌株37 株。如圖1所示，菌株YJ-110在MRS固體平板上直徑為1～2 mm，白色，不透明，菌落凸起有溶鈣圈，光滑圓整，邊緣整齊。革蘭氏染色為G+菌，橢球狀，少數成對或成鏈狀，無芽孢。

圖1　菌株YJ-110的菌落特征（a）及個體形態（b）圖（10×10000）Fig.1 Colony characteristics （a） and morphological features （b） of strain YJ-110 （10×100）

2.1.2產雙乙酰菌株的初篩結果

采用鄰苯二胺顯色法測定雙乙酰的含量，其標準曲線的回歸方程為y=0.040 3x-0.033 2（R2=0.998 6），表明總誤差中只有0.14%屬于隨機因素的影響，故該回歸直線可用于確定待測樣的雙乙酰含量。

以初篩37 株菌株活化后，菌齡為18 h的培養菌液，按2%接種于12%的脫脂乳培養基中，37 ℃條件下培養24 h后，用紫外分光光度計測得OD335nm值，根據雙乙酰標準曲線回歸方程可計算出37 株菌株產雙乙酰的含量，結果見表1。YJ-103、YJ-105、YJ-110、YJ-202、YJ-203、YJ-322、YJ-324這7 株菌產雙乙酰的能力較強，因此將產量較高的這7 株菌進行下一步復篩實驗。

表1　產雙乙酰菌株初篩結果Table1 Results of preliminary screening for diacetyl production

2.1.3產雙乙酰菌株的復篩結果

將初篩所得的7 株菌株活化，取菌齡為18 h的菌懸液，以2%量接種于12%的脫脂乳培養基中，在37 ℃條件下搖床培養24 h后，測得OD335nm值，根據所得雙乙酰標準曲線回歸方程可計算出7 株菌株產雙乙酰的含量，結果見表2。YJ-110菌株是產雙乙酰含量最高的菌株，產雙乙酰的平均量為23.826 mg/L。對比表1中的數據，發現同樣在37 ℃、24 h培養條件下，通過搖床培養菌株較靜置培養產雙乙酰的含量有所增加。這主要可能是由于溶氧量改變導致的。

表2　產雙乙酰菌株復篩結果（n=3）Table2 Results of secondary screening for diacetyl production （n=3）

2.2菌種的鑒定

2.2.1生理生化鑒定結果

對菌株YJ-110進行生理生化實驗，測定結果查閱《細菌鑒定手冊》和《伯杰氏手冊》，鑒定菌株YJ-110為嗜檸檬酸明串珠菌（Leuconostoc citreum），結果見表3。

表3　菌株YJ-110的生理生化反應鑒定Table3 Identification of strain YJ-110 by physiological characteristics and biochemical reactions

2.2.2分子生物學鑒定

對PCR產物進行測序，并將結果在NCBI上進行BLAST在線分析，其同源性序列相似度比較發現，與Leuconostoc citreum KM20最接近，相似度為99%。圖2為所篩37 株菌中部分菌株的16S rDNA的電泳圖，可以發現所有的菌株序列長度均在1 500 bp左右，在1 000～2 000 bp之間，符合目的基因的分子質量。

圖2　菌株的16S rDNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis patterns of 16S rDNA

綜合細菌形態學、生理生化特征和16S rDNA比對，該菌株鑒定為嗜檸檬酸明串珠菌（Leuconostoc citreum）。

3　結 論

雙乙酰測定過程中，樣品的處理是必要的過程。劉鵬等［15］在測定樣品雙乙酰時，先將樣品用蒸餾水稀釋后，采用蒸餾的方法，利用乙醚等有機溶劑冰浴回收，然后萃取得到雙乙酰待測樣品。但發現這種方法耗時長，樣品中的雙乙酰在萃取回收時有一定的損失。所以本實驗用16%的三氯乙酸將樣品中的蛋白沉淀，然后用離心機離心過濾得到透明溶液再進行測定。這種方法需要時間少，也減少了樣品中雙乙酰的損失，保證了測定的準確性［16-17］。

在進行產雙乙酰菌株篩選的過程中，分別對培養菌株進行了初篩和復篩。將初篩和復篩的方案和數據進行對比后，發現同樣在37 ℃、24 h培養條件下，通過搖床培養菌株較靜置培養產雙乙酰的含量有所增加，這與Vedamuthu［18］報道的在生產中振蕩培養可以促進雙乙酰生成的結果相符，也與邵亞東［19］的結論有相似之處。對于雙乙酰含量測定，邵亞東［19］篩選的最高產雙乙酰菌株QH5-6產量達34.34 mg/L，彭濤等［20］篩選的最高產雙乙酰菌株S1產量為16.287 mg/L，與本實驗研究所得的數據有一定的差別，究其原因可能是由于實驗材料的不同或者紫外分光光度計的光源強弱等因素造成的差異。

本實驗從采集的郫縣生鮮乳和伊利暢輕原味風味發酵乳中分離得到的39 株乳酸菌，經兩次篩選出一株產雙乙酰能力最強的菌株YJ-110，通過細菌形態學、生理生化特征和16S rDNA比對，鑒定YJ-110菌株為嗜檸檬酸明串珠菌。該菌株的獲得不僅可為解決因化學合成生產雙乙酰帶來的環境污染等一系列問題提供理論基礎，也可為滿足食品行業對天然雙乙酰等風味物質的需求提供實用價值。

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Isolation and Identification of High-Level Diacetyl-Producing Lactic Acid Bacteria from Milk Products

TIAN Yujuan， ZHOU Kang*， HAN Xinfeng， LIU Shuliang
（College of Food Science， Sichuan Agricultural University， Ya’an 625014， China）

In this study， using MRS medium， we isolated 39 strains from raw milk and fermented milk from Sichuan province， of which 37 were found to be capable of diacetyl. Seven strains with increased diacetyl-producing ability were selected from the 37 strains and YJ-110， a Lactobacillus strain， produced the highest yield （23.826 mg/L as measured by spectrophotometer） of diacetyl among the seven strains. Based on morphological， physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequences， this strain was identified as Leuconostoc citreum.

diacetyl； isolation and identification； Leuconostoc citreum

TS254

A

1002-6630（2015）03-0162-04

10.7506/spkx1002-6630-201503031

2014-02-21

田玉娟（1990—），女，本科，研究方向為食品生物技術。E-mail：690813931@qq.com

周康（1983—），男，副教授，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：kang_zhou@163.com