牛乳源金黃色葡萄球菌耐藥性變遷及β-內酰胺類藥物耐藥基因分析

凡 琴，劉書亮*，吳聰明，韓新鋒周 康劉冬香侯小剛

（1.四川農業大學食品學院，四川 雅安 625014；2.宜賓市南溪區食品藥品監督管理局，四川 宜賓 644100；3.中國農業大學動物醫學院，北京 100194）

牛乳源金黃色葡萄球菌耐藥性變遷及β-內酰胺類藥物耐藥基因分析

凡 琴1，2，劉書亮1，*，吳聰明3，韓新鋒1，周 康1，劉冬香1，侯小剛1

（1.四川農業大學食品學院，四川 雅安 625014；2.宜賓市南溪區食品藥品監督管理局，四川 宜賓 644100；3.中國農業大學動物醫學院，北京 100194）

采用肉湯微量稀釋法，對203 株源于2006—2011年四川牛乳源金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，Sa）進行10 種常用抗生素藥敏性檢測，多重聚合酶鏈式反應（multiplex polymerase chain reaction，M-PCR）法對其耐甲氧西林基因（mecA）和β-內酰胺類藥物耐藥基因（blaZ）進行分析，了解Sa耐藥性變遷。結果表明：牛乳源Sa菌株對青霉素、氨芐西林耐藥率一直居高不下；對阿莫西林/克拉維酸、紅霉素、甲氧芐啶/磺胺甲噁唑耐藥率有增強趨勢；對林可霉素、四環素耐藥率呈降低趨勢；對環丙沙星耐藥率不定；對苯唑西林和頭孢噻呋敏感；Sa分離株多重耐藥率介于72.1%～100.0%，顯示出不盡相同的耐藥譜，卻呈現出不斷增寬的趨勢。M-PCR檢測顯示，2006—2011年分離Sa菌株未從基因水平擴增出mecA基因；不同年度分離株均不同程度攜帶blaZ基因，不同年度分離株blaZ+檢出率介于49.1%～87.5%。藥敏實驗結果與相關耐藥基因檢測結果存在對應關系，部分菌株的耐藥性與耐藥基因的檢出率不一致，推測還存在其他耐藥機制。結論：四川地區牛乳源金黃色葡萄球菌耐藥性不容樂觀。

生牛乳；金黃色葡萄球菌；耐藥性；多重聚合酶鏈式反應；β-內酰胺類耐藥基因

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，Sa）是臨床菌株耐藥的典范。近年，隨著“食品中耐藥細菌的危險性”引起重視，人們也開始對食源Sa的耐藥性進行研究。β-內酰胺類藥物應用廣泛，Sa產生由blaZ基因編碼的β-內酰胺酶，特別是產生由mecA基因編碼的PBP2a對該類藥物嚴重耐藥已引起廣泛關注。國外多項研究表明具有高傳染性的、多重耐藥性的Sa在歐盟、土耳其、朝鮮、日本、加拿大和美國的豬肉、方便食品、乳及乳制品等食品中大量存在并流行，且呈現逐步增強的情況［1-7］，在中國，Sa是引起奶牛乳腺炎疾病的重要致病菌之一，該菌在牛乳中廣泛存在且對多種藥物產生耐藥性［8］。為研究牛乳源Sa耐藥性與其相關耐藥基因的關系，實時監控Sa耐藥性年度變遷規律，本實驗通過對2006—2011年四川省部分乳品生產企業生鮮牛乳中的Sa分離株進行耐藥性分析及blaZ、mecA耐藥基因監測，以期對四川省生鮮牛乳中不同年度金黃色葡萄球菌的耐藥性進行監測，為牛乳源Sa耐藥性的安全評價提供依據，為我國政府及食品衛生監督機構建立、發展和完善食源性致病菌及食源性疾病的監測、預警系統提供參考。

1　材料與方法

1.1菌株、培養基及試劑

實驗菌株：203 株金黃色葡萄球菌（其中2006年8 株，2007年44 株，2008年17 株，2009年53 株，2010年38 株，2011年43 株），于2006—2011年度自四川省部分牛乳生產企業的生牛乳中分離鑒定，由四川農業大學食品微生物室保存。

標準菌株：金黃色葡萄球菌ATCC 29213，用于藥敏實驗的質量控制；金黃色葡萄球菌ATCC 33591（nuc+、mecA+、blaZ+），用于多重聚合酶鏈式反應（multiplex polymerase chain reaction，M-PCR）擴增nuc、mecA、blaZ基因的陽性對照，均為四川農業大學食品微生物實驗室保存。

Mueller-Hinton（M-H）肉湯、Mueller-Hinton Agar（M-H瓊脂） 杭州微生物試劑有限公司；LB培養基自配。

紅四氮唑（2，3，5-triphenyl tetrazolium chloride，TTC） 上海靈錦精細化工有限公司；PCR用溶菌酶、2×Taq PCR MasterMix、DL2000 DNA Marker、GoldViewTMDNA染料 天根生化科技有限公司。

藥敏實驗用抗生素均為原藥粉，購自中國獸醫藥品監察所，具體信息見表1。

表1　藥敏實驗用抗生素（組合）Table1 Individual or combined antibiotics for susceptibility testing

1.2方法

1.2.1藥物敏感性測定方法

將保存的Sa菌株劃線于M-H平板，37 ℃培養24 h，再傳代一次，恢復其活性；按照美國臨床實驗室標準委員會（CLSI 2010）微量肉湯稀釋法對Sa菌株進行10 種抗生素的敏感性測定，以Sa標準菌株ATCC 29213為質控菌株。

當質控菌在CLSI（2010）規定的藥敏范圍時，參考CLSI（2010）（表2）藥敏標準，對受試菌的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）進行判定。將供試菌分為敏感（S）、中介（I）和耐藥（R）3 種。

將對3 類或3 類以上抗菌藥物同時呈現耐藥的供試菌判定為多重耐藥菌（multidrug-resistant organism，MDRO），即判定該供試菌具有多重耐藥性。

表2　藥敏實驗用抗生素及耐藥判定標準Table2 Antibiotics and breakpoints of drug-resistance

1.2.2M-PCR檢測nuc、blaZ及mecA基因

根據天根細菌基因組DNA提取試劑盒提取Sa總DNA，制備PCR模板，參考劉書亮等［9］的方法進行M-PCR檢測Sa分離株中的nuc、blaZ及mecA基因，以金黃色葡萄球菌ATCC 33951為陽性對照菌（nuc+、blaZ+、mecA+）。

2　結果與分析

2.1Sa對10 種常見抗生素的藥敏性

采用肉湯微量稀釋法對10 種抗生素（組合）藥敏實驗結果（表3）表明，所有Sa菌株對PEN的耐藥率（93.1%）最高，其次AMP（92.1%）、AMC（52.7%）、SXT（48.8%）、TET（42.9%）、CLI（30.0%）、ERY（29.6%）、CIP（1.5%）；對CLI、ERY、TET、CIP的中介耐藥率分別為18.2%、9.9%、4.4%、3.4%；對OXA和CEF敏感。

表3　不同年度金黃色葡萄球菌的耐藥率Table3 Drug resistant rate ofSSaa from different yearss

隨著年度變遷，S a對抗生素的耐藥性有差異。2006—2011年Sa分離株對PEN、AMP具有很強的耐藥性，其耐藥率范圍分別在82.5%～100%及60.5%～100%；對AMC、ERY、SXT及CIP耐藥性明顯增強，從敏感逐步變遷到耐藥，其耐藥率最高分別達100.0%、82.4%、94.7%及36.8%；對CLI、TET的耐藥率明顯降低，最低耐藥率均分別為6.8%和2.6%。不同年度Sa分離株對同一抗生素耐藥率有差異，這可能與奶牛養殖過程中抗生素違規使用及使用頻率相關。

2.2Sa的多重耐藥性

203 株Sa分離株中僅有2 株對10 種抗生素均敏感，其余菌株至少耐受一種藥物。多重（≥3）耐藥Sa檢出率為83.7%（表4），其中4 重耐藥菌株最多，占全部菌株的28.1%，其次為3 重（23.2%）、5 重（18.2%）、6 重（12.3%）、7 重（2.0%）。

本實驗中，Sa隨著年度變遷，多重耐藥性增強。多重耐藥Sa在2010年最為嚴重，分離率達100.0%，其他依次是2009年84.9%、2008年82.4%、2007年81.8%、2006年75.0%、2011年72.1%。不同年度Sa可耐受的抗生素種數不同，最多可耐受7 種抗生素。2006年分離Sa可耐受抗生素是4 重（62.50%）、3 重（12.50%）；2007年分離Sa可耐受藥物主要為3 重、4 重、5 重，分別占2007年Sa總菌數的36.4%、22.7%、18.2%；2008年分離Sa可耐受抗生素為3 重（52.9%）、4 重（23.5%）、6 重（5.9%）；2009年分離Sa以4 重（47.2%）、3 重（22.6%）、5 重（11.3%）耐藥菌株居多；2010年分離Sa中發現7 重耐藥菌株，6 重（36.8%）、5 重（26.3%）、4 重（18.4%）、3 重（10.5%）、7 重（7.9%）等多重耐藥菌株較為常見；與2010年Sa分離株相同，2011年Sa亦有耐受7 重耐藥菌株出現（2.3%），以5 重（30.2%）、4 重（14.0%）、6 重（14.0%）、3 重（11.6%）為主要耐藥模式。不同年度分離的Sa的多重耐藥性變遷分析表明，Sa耐受抗生素種類有增加的趨勢。

表4　不同年度金黃色葡萄球菌的多重耐藥率Table4 Percentage of multi-drug resistance strains of SaSa from rom different years ears

2.3不同年度菌株耐藥譜的變化規律

由表4可知，203 株Sa對10 種常見抗生素（組合）共產生42 種耐藥譜，其中較為優勢耐藥譜為：PEN-AMPAMC-TET（28/203），PEN-AMC-AMP-ERY-CLI-TET（20/203），PEN-AMC-AMP（17/203），PEN-AMP-TET（15/203），PEN-AMP-ERY-CLI-SXT（14/203），PENAMP（13/203），PEN-AMP-AMC-TET-SXT（11/203）。不同年度菌株耐受抗菌藥物有所不同，2006年菌株耐藥譜極窄，僅對PEN、AMP、TET、CLI這4 種抗生素耐藥（75.0%）；2007年以耐PEN、AMP、TET或兼耐SET、AMC、ERY、CLI為主（81.8%），耐藥譜增寬；2008年菌株對PEN、AMC、AMP的耐藥性已趨于穩定（＞82.4%），并兼對CLI、SXT、CIP等藥物耐藥，耐藥譜又增寬，2009年分離株以耐PEN、AMP、AMC、TET或兼耐CLI、SXT、ERY為主（84.9%），2010年分離株對PEN、AMP、AMP、ERY、CLI、SXT的耐藥性已趨于穩定，并兼對TET、CIP等藥物耐藥，耐藥譜又增寬，在上述藥物的基礎上，2011年菌株主要對PEN、AMC、AMP、ERY、SXT、CLI等藥物產生抗性，對TET也表現出一定的耐藥性，耐藥譜較2010年有了明顯的增寬。

2.4M-PCR檢測nuc、blaZ及mecA結果

對203 株Sa進行M-PCR檢測的結果（圖1）顯示，98.0%（199/203）的分離株nuc+，63.1%（128/203）的菌株攜帶blaZ基因，所有菌株均未檢出mecA基因。不同年度分離株均不同程度攜帶blaZ基因，不同年代分離株blaZ+檢出率依次是：2006年87.5%（7/8）、2007年63.6%（28/44）、2008年58.8%（10/17）、2009年49.1%（26/53）、2010年81.6%（31/38）、2011年60.5%（26/43）。該結果表明，隨著年度增加，Sa分離株blaZ基因檢出率有先降后升趨勢，這可能與不同年度奶牛養殖過程中抗生素使用頻率及高耐藥水平菌株為抵御相關環境高抗生素水平壓力作用在傳代過程中有“適者生存”的選擇規律相關。

圖1　部分SSaa菌株多重PCRR檢測結果Fig.1 Multiplex PCR test results of some Sa strains

基因與表型有一定的對應關系，blaZ編碼β-內酰胺酶，導致菌株對β-內酰胺類抗生素（PEN、AMP、AMC）耐藥。203 株Sa分離株的β-內酰胺類抗生素敏感性結果與PCR結果進行比較，對一種及以上β-內酰胺類抗生素（PEN、AMP、AMC）耐藥、blaZ陽性和對β-內酰胺類抗生素（PEN、AMP、AMC）同時敏感、blaZ陰性的菌株各占65.8%（127/193）和90.0%（9/10），對β-內酰胺類抗生素（PEN、AMP、AMC）敏感性分析結果和blaZ擴增結果同時符合的菌株占67.0%（136/203）。不同年度分離株對β-內酰胺類抗生素（PEN、AMP、AMC）敏感性分析結果和blaZ擴增結果比較詳見表5，可以看出2006—2011年表型耐β-內酰胺類抗生素菌株與基因型符合率分別為100.0%、65.1%、58.8%、50.0%、81.6%、69.4%，部分表型耐β-內酰胺類抗生素菌株blaZ檢測結果呈陰性。

表5　Sa對β-內酰胺類抗生素敏感性結果與blaZ擴增結果對比分析Table5 Comparisons between the sensitivity to -lactams and the detection of blaZ gene using PCR

3　結論與討論

藥敏實驗結果表明，Sa分離株對PEN（93.1%）、AMP（92.1%）、AMC（52.7%）、SXT（48.8%）、TET（42.9%）、CLI（30.0%）、ERY（29.6%）具有較高耐藥性，這與蔡雪鳳等［8］（PEN 88%、AMP 68%、ERY 56%、TET 38%）、Pereira等［10］（PEN 73%、AMP 70%）、劉冬香等［11］（PEN93.8%、AMP 92.92%、CLI 47.79%、TET 42.48%、ERY 41.59%、SXT 38.05%）、Nemati等［12］（TET 56.8%、PEN 44.4%、ERY 37%）、Pesavento等［13］（AMP 42.86%、TET 19.04%、SXT 4.76%、CLI 21.43%、PEN 16.66%）相關文獻對食源性Sa耐藥性研究結果基本一致，但耐藥率研究結果存在異同，且各文獻報道也存在差異［8，10-13］。這可能與不同國家和地區養殖業中抗生素使用頻率相關。研究表明四川地區牛乳源Sa對PEN、AMP、AMC、TET、SXT耐藥現象仍較為嚴重，在年度變遷中，Sa對CLI、TET的耐藥性有降低趨勢，CIP、CEF仍是治療奶牛疾病的有效獸藥。

細菌多重耐藥性的產生是各種抗生素使用的結果，本實驗結果顯示，四川地區牛乳源Sa多重耐藥性嚴重（83.7%），主要表現對抗生素3～6 重耐藥（81.8%）。其中2010年Sa分離株多重耐藥最為嚴重，多重耐藥率達100.0%，且檢出7 重（7.9%）耐藥菌。在6 年時間里，牛乳源Sa分離株耐藥率大幅度上升，多重耐藥菌株急劇增多，耐藥譜也迅速增寬，并對常用抗菌藥物廣譜耐藥。臨床上抗生素的廣泛使用及不合理使用是細菌耐藥性產生的主要原因，如Sa菌株對青霉素類藥物、紅霉素、磺胺類藥物、環丙沙星的耐藥性。

PEN、AMP及AMC都是臨床常用β-內酰胺類抗生素。Sa菌株通過blaZ基因編碼產生β-內酰胺酶繼而破壞β-內酰胺環從而對青霉素類耐藥及捕獲mecA基因并編碼與藥物親和力低的青霉素結合蛋白PBP2a，保持細胞壁的合成，使抗生素無法進入細胞內破碎病原菌是Sa菌株對β-內酰胺類抗生素耐藥的兩種主要機制［2］。本實驗就2006—2011年Sa分離株進行耐甲氧西林的Sa（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）監測，藥敏實驗表型檢測MRSA與PCR擴增mecA基因從基因水平檢測MRSA均陰性，符合率100.0%，表明近年來該地區乳品源Sa中無MRSA存在；相反blaZ+檢出符合率在50.0%～100.0%，表型耐β-內酰胺類藥物（PEN、AMP、AMC）菌株與PCR擴增blaZ+符合率為65.8%（127/193），該結果表明，藥敏實驗結果與相關耐藥基因檢測結果存在對應關系，菌株內源blaZ基因編碼β-內酰胺酶是本實驗Sa分離株對β-內酰胺類藥物耐受的主要原因，但部分菌株的耐藥性與相關耐藥基因的檢出率不一致，推測還存在其他耐藥機制，具體原因有待進一步研究。

Sa和MRSA進入食物鏈已是不爭的事實［1，14-18］（Lee［14］研究發現22%的用于食品加工的動物性樣品被Sa污染，其中3.6%攜帶mecA基因；Inge等［15］研究發現42.2%的豬肉樣品和33.3%的牛肉樣品中含有Sa，MRSA分離率為2.5%；Lozano等［16］研究發現1.6%的西班牙動物性食品含MRSA；Pu等［17］研究發現45.6%的豬肉樣品和20%的牛肉樣品Sa陽性，檢測出6 株MRSA。Bystron等［18］研究發現從132 株食源Sa中檢出8 株（6.1%）苯唑西林耐藥菌株，包括2 株來自豬肉的mecA陽性MRSA。Waters等［1］研究發現77%的火雞肉、42%的豬肉，41%的雞肉，37%的牛肉被Sa污染，在牛肉、豬肉及火雞肉中各檢出一株MRSA）。耐藥性Sa可能具有更多的致病機會，并有可能引起一定程度的食品安全問題，如社區感染性疾?。?9］、食物中毒事件［20］。近年MRSA在社區的流行，由Sa引起的中毒和疾病事件不可避免將給臨床治療帶來非常棘手的問題。四川地區牛乳源金黃色葡萄球菌耐藥性不容樂觀。因此，為防止牛乳源Sa尤其MRSA通過食物鏈進入人體腸道使腸道正常菌群產生耐藥性或耐藥性增強，威脅人體健康，有必要加強牛乳源Sa尤其是MRSA的耐藥性持續監測，了解耐藥性的動態變遷，為乳品源Sa耐藥性的安全評價提供依據。

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Drug Resistance Changes and Analysis of Beta-Lactam Drug Resistance Genes in Staphylococcus aureus from Fresh Milk

FAN Qin1，2， LIU Shuliang1，*， WU Congming3， HAN Xinfeng1， ZHOU Kang1， LIU Dongxiang1， HOU Xiaogang1
（1. College of Food Science， Sichuan Agricultural University， Ya’an 625014， China；2. Nan Xi Food and Drug Administration， Yibin 644100， China；3. College of Veterinary Medicine， China Agricultural University， Beijing 100194， China）

This study aimed to understand the changes in drug resistance of Staphylococcus aureus （Sa）. A total of 203 strains of Sa collected during 2006 to 2011 were tested against 10 antibiotics by broth micro-dilution method for determining their antibiotic susceptibility. With multiplex polymerase chain reaction （M-PCR） method， the methicillin-resistant gene（mecA） and beta-lactam drug resistance gene （blaZ） of Sa were analyzed. The results showed that the resistance rates of Sa isolates to penicillin and ampicillin acid were high. An increasing trend was observed for the resistance rates of Sa to amoxicillin/clavulanic， erythromycin， and trimethoprim/sulfamethoxazole. There was an uncertain resistance rate to ciprofloxacin whereas the resistance rates of Sa isolates to clindamycin and tetracycline showed a decreasing trend. All the strains tested were sensitive to both oxacillin and ceftiofur. The multidrug-drug resistant rates of Sa from different years ranged from 72.1% to 100.0%， with different drug-resistant spectra， but at the same time， they presented a continuously widened trend. M-PCR analysis showed that no mecA gene was amplified from Sa strains collected during 2006 to 2011. During different years， more or less isolates carrying the gene blaZ were detected， and the detection rates of blaZ+from different years ranged from 49.1% to 87.5%. There was a certain relationship between the susceptibility test results and the related drug resistance gene detection results. The detection rates of some drug-resistant strains were inconsistent with their resistance genes suggesting that there are other resistance mechanisms for Sa. The drug resistance of Sa from fresh milk in Sichuan was not optimistic.

fresh milk； Staphylococcus aureus； drug resistance； multiplex polymerase chain reaction （M-PCR）； β-lactam drug resistance genes

R155.31

A

1002-6630（2015）03-0147-05

10.7506/spkx1002-6630-201503028

2014-02-27

公益性行業（農業）科研專項（200903055）

凡琴（1986—），女，碩士研究生，研究方向為食品微生物與發酵工程。E-mail：shellamimosa@126.com

劉書亮（1968—），男，教授，博士，研究方向為食品微生物與發酵工程。E-mail：lsliang999@163.com