沒食子酸對豬胰α-淀粉酶和蛋白酶的抑制作用

秦 昱，邵元元，熊 碩，滕 杰，豐金玉，肖文軍*

（湖南農(nóng)業(yè)大學 國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410128）

沒食子酸對豬胰α-淀粉酶和蛋白酶的抑制作用

秦 昱，邵元元，熊 碩，滕 杰，豐金玉，肖文軍*

（湖南農(nóng)業(yè)大學 國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410128）

以沒食子酸為材料，通過考察酶質(zhì)量濃度、反應體系中底物和酶及沒食子酸添加順序、不同反應時間、不同沒食 子酸質(zhì)量濃度對豬胰α-淀粉酶、蛋白酶的活性影響，研究沒食子酸對兩種酶的 抑制作用。結(jié)果表明，在底物質(zhì)量濃度為1 g/100 mL、體系添加順序為酶液與抑制劑沒食子酸溶液37 ℃預溫5 min后加入底物溶液的條件下，沒食子酸抑制豬胰α-淀粉酶活性最優(yōu)條件為：α-淀粉酶質(zhì)量濃度0.64 mg/mL，反應時間15 min，沒食子酸對α-淀粉酶的最大抑制率為95.52%；在體系添加順序為酶液與抑制劑沒食子酸溶液40 ℃預溫5 min后加入底物溶液的條件下，沒食子酸抑制豬胰蛋白酶活性的最優(yōu)條件為：胰蛋白酶質(zhì)量濃度0.63 mg/mL，反應時間30 min，沒食子酸對胰蛋白酶的最大抑制率為99.24%。沒食子酸對兩種酶的抑制效果均隨沒食子酸質(zhì)量濃度的增大而增強。

沒食子酸；豬胰α-淀粉酶；豬胰蛋白酶；抑制作用

沒食子酸為3，4，5-三羥基苯甲酸，具有抗炎［1］、抑菌［2］、抗氧化［3］、抗病毒［4］、抗腫瘤［5］、殺錐蟲［6］等多種生物學活性，廣泛用于食品、醫(yī)藥、化工、有機合成、輕工及電子等行業(yè)［7-10］。研究表明，對脂質(zhì)代謝相關(guān)酶類的抑制作用是探討降糖降脂作用機理的一種有效方法［11］，利用α-淀粉酶抑制劑開發(fā)的新型口服抗糖尿病藥物，可以降低血糖和血脂水平，防治糖尿病、高血脂、肥胖癥等疾病［12］。胰蛋白酶抑制劑在臨床上主要用于治療急性胰腺炎、心腦血管疾病、抑制腫瘤細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移等［13］，相關(guān)資料表明，胰蛋白酶抑制劑也具有降糖降脂活性［14-15］。有研究利用碘-淀粉比色法探討沒食子酸對α-淀粉酶活性的影響作用［11，16］，但就其影響作用究竟是抑制還是促進效果未能得出一致結(jié)論，同時，當前尚未見有關(guān)沒食子酸對胰蛋白酶活性影響的研究報道。因此，深入研究沒食子酸對豬胰α-淀粉酶和蛋白酶的抑制作用，揭示其調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝作用效果，將對沒食子酸的開發(fā)利用和調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝功能產(chǎn)品的開發(fā)具有重要意義。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

沒食子酸（純度≥98%，批號：NO.20120914）湖南張家界奧威生物科技有限公司；豬胰α-淀粉酶（A3176，500 U/mg）、豬胰蛋白酶（T4799，1 000～2 000 BAEE units/mg） 美國Sigma公司；拜唐平拜耳醫(yī)藥保健有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

3，5-二硝基水楊酸（3，5-nitro salicylic acid，DNS）溶液、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）溶液分別為終止α-淀粉酶和蛋白酶反應的終止劑。

1.2儀器與設(shè)備

AUW220D精密電子天平 日本島津公司；pHS22C型pH計 上海雷磁儀器廠；HH數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市金城國勝實驗儀器廠；SK3300LH超聲波清洗器上海科導超聲儀器有限公司；UV-2600型紫外-可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司。

1.3方法

沒食子酸對豬胰α-淀粉酶及胰蛋白酶的抑制作用采用非連續(xù)測定和作圖法，α-淀粉酶酶活力測定參照Bernfeld法［17-18］進行，胰蛋白酶酶活力測定參照文獻［19］方法，IC50的計算采用SPSS軟件中Profit分析方法，其中響應頻率為抑制劑的抑制率，協(xié)變量為抑制劑質(zhì)量濃度。

1.3.1沒食子酸對豬胰α-淀粉酶活性影響條件優(yōu)化

1.3.1.1葡萄糖標準曲線制作

稱取葡萄糖0.1 g，加蒸餾水定容至50 mL，配制成葡萄糖標準液。準確量取標準液0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mL，分別置于10mL容量瓶中，37 ℃預溫5 min后，各加入0.5mL DNS溶液，沸水浴5 min，冷卻，加水定容至刻度。以不加葡萄糖溶液為空白，于540 nm波長處測定吸光度。得到標準曲線方程為y = 13.400 5 x+0.069 2（R2= 0.995 9）。

1.3.1.2酶質(zhì)量濃度篩選

取7 支試管，于不同試管中加入不同質(zhì)量濃度的α-淀粉酶溶液（0.16、0.32、0.48、0.64、0.80、0.96、1.12 mg/mL），與1.0 g/100 mL可溶性淀粉溶液反應，測定不同質(zhì)量濃度α-淀粉酶與底物反應的關(guān)系，并作圖考察，選出合適的反應酶質(zhì)量濃度。

1.3.1.3反應時間篩選

取5 支試管，于每根試管中分別加入一定質(zhì)量濃度的α-淀粉酶溶液，測定不同反應時間（5、10、15、20、25 min）下還原性糖生成量，作圖確定α-淀粉酶的最適反應時間。

1.3.1.4底物、酶、抑制劑添加順序篩選

以1.3.1.3節(jié)最適反應時間為基礎(chǔ)，將底物可溶性淀粉溶液、豬胰α-淀粉酶、抑制劑沒食子酸按以下3 種順序加入：A）可溶性淀粉溶液、α-淀粉酶、沒食子酸于37 ℃分別預熱5 min后，一起加入到試管中反應；B）可溶性淀粉溶液與沒食子酸37 ℃預熱5 min，然后加入α-淀粉酶反應；C）沒食子酸與α-淀粉酶37 ℃預熱5 min，然后加入可溶性淀粉溶液反應；分析3 種方式下各抑制效果，篩選最佳添加順序。

1.3.1.5最優(yōu)條件下沒食子酸對豬胰α-淀粉酶的抑制效果

在不同試管中分別加入質(zhì)量濃度為1、3、5、7、9、

11、13、15 mg/mL的沒食子酸，經(jīng)過預實驗探索，酶與底物反應體積均選0.3 mL。按表1所示添加反應物后，沸水浴5 min，冷卻、稀釋，于540 nm波長處測定吸光度。其中，陽性對照為拜糖平溶液，背景對照為對應質(zhì)量濃度的抑制劑及底物溶液。α-淀粉酶抑制劑活力單位定義為：在37 ℃，pH 6.8條件下降低1 個酶活力單位為抑制劑一個抑制活力單位。

表1　豬胰-淀粉酶活性抑制體系Table1 Reaction systems for inhibition of porcine pancreatic-amylase

抑制劑對α-淀粉酶的抑制率計算公式為：

式中：A1、A2、A3、A4分別為540 nm波長處無抑制劑組、空白組、加抑制劑組和背景對照組的吸光度。

1.3.2沒食子酸對豬胰蛋白酶活性影響條件優(yōu)化

1.3.2.1酪氨酸標準曲線制作

稱取L-酪氨酸0.100 g，用1 mol/L的鹽酸60 mL溶解后定容至100 mL，即為1.00 mg/mL的酪氨酸溶液。吸取1.8 mL酪氨酸溶液，用0.1 mol/L鹽酸定容至10 mL，即得0.18 mg/mL L-酪氨酸標準溶液。按表2順序添加后，離心，取上清液，以1號試管為空白，280 nm波長處測定吸光度，并繪制不同質(zhì)量濃度酪氨酸與吸光度的關(guān)系圖，獲得標準曲線方程為y = 65.944 x+0.024 9（R2= 0.998 9）。

表2　酪氨酸標準曲線試劑加入量Table2 Amounts of reagents used for preparation of tyrosine standard curve mL

1.3.2.2酶質(zhì)量濃度篩選

取6 支試管，于不同試管中加入不同質(zhì)量濃度的胰蛋白酶溶液（0.126、0.252、0.378、0.504、0.630、0.756 mg/mL），與1.0 g/100 mL酪蛋白溶液反應，測定不同質(zhì)量濃度胰蛋白酶與底物反應的關(guān)系，并作圖考察，選出合適的反應酶質(zhì)量濃度。

1.3.2.3反應時間篩選

取6 支試管，于每根試管中分別加入一定質(zhì)量濃度的胰蛋白酶溶液，測定不同反應時間（5、10、20、30、40、50 min）下產(chǎn)物生成量，作圖確定胰蛋白酶的最適反應時間。

1.3.2.4底物、酶、抑制劑添加順序篩選

以1.3.2.3節(jié)中篩選出的最適反應時間為基礎(chǔ)，將底物酪蛋白溶液、豬胰蛋白酶、抑制劑沒食子酸按以下3 種順序加入：A）酪蛋白溶液、胰蛋白酶、沒食子酸于40 ℃分別預熱5 min后，一起加入到試管中反應；B）酪蛋白溶液與沒食子酸40 ℃預熱5 min，然后加入胰蛋白酶反應；C）沒食子酸與胰蛋白酶40 ℃預熱5 min，然后加入酪蛋白溶液反應；分析3 種方式下各抑制效果，篩選最佳添加順序。

1.3.2.5最優(yōu)條件下沒食子酸對豬胰蛋白酶的抑制效果

在不同試管中分別加入質(zhì)量濃度為0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2 mg/mL的沒食子酸，經(jīng)過預實驗探索，酶與底物反應體積分別選0.5 mL和1.0 mL。按表3所示添加反應后，立即加入TCA溶液終止反應，搖勻靜置，加蒸餾水稀釋，離心，取上清液，于280 nm波長處測定吸光度。豬胰蛋白酶抑制劑活力單位定義為：在40 ℃，pH 8.0條件下降低1 個酶活力單位為抑制劑一個抑制活力單位。

抑制劑對豬胰蛋白酶的抑制率計算公式同豬胰α-淀粉酶抑制率計算公式，公式（1）、（2）中A值均為在280 nm波長處的吸光度。

表3　豬胰蛋白酶活性抑制體系Table3 Reaction systems for inhibition of porcine pancreatic trypsin

2　結(jié)果與分析

2.1沒食子酸對豬胰α-淀粉酶酶活性抑制作用

2.1.1酶質(zhì)量濃度確定

圖1　豬胰α-淀粉酶質(zhì)量濃度對酶活性的影響Fig.1 Effect of pancreatic α-amylase concentration on the enzymatic activity

由圖1可知，隨著酶質(zhì)量濃度的增加，吸光度增大，淀粉酶質(zhì)量濃度在0.16～0.64 mg/mL范圍內(nèi)，有較好的線性關(guān)系，隨著酶質(zhì)量濃度的增加，底物被快速消耗，酶與底物的反應速率減慢，最終將達到平衡。由圖中可以看出，要使酶與底物保持最大反應速率，α-淀粉酶質(zhì)量濃度選擇在0.64 mg/mL較為合適。

2.1.2反應時間確定

圖2　最佳反應時間的選擇Fig.2 Selection of optimal reaction time

還原性糖生成量隨反應時間變化的關(guān)系如圖2所示，當反應時間在0～15 min時，吸光度與時間基本呈線性關(guān)系，隨著時間延長，吸光度變化減小，還原性糖含量增長 減慢，說明在15 min內(nèi)的反應速率可認為近似達到初始速率。因此，體系最適反應時間選擇15min較為合適。

2.1.3酶、底物、抑制劑（沒食子酸）添加順序確定

圖3　反應體系中添加順序?qū)σ种谱饔玫挠绊慒ig.3 Effect of addition sequence of reactants on α-amylase inhibition

由圖3可知，沒食子酸的A、B、C 3 種加入順序的抑制率分別為25.97%、19.54%、30.36%。結(jié)果表明，A、B、C 3 種添加順序的抑制率差異不顯著（P＞0.05），從圖3可以看出順序C（沒食子酸與α-淀粉酶先進行預熱，再加入淀粉溶液反應）的抑制效果最佳，而順序B的抑制率相對較小，以順序C為最佳添加順序，與莊玲玲［20］、劉雯［21］等實驗中淀粉酶抑制作用建立所用的添加順序一致。

2.1.4最優(yōu)條件下沒食子酸對豬胰α-淀粉酶的抑制效果

圖4　不同質(zhì)量濃度沒食子酸對豬胰α-淀粉酶活性的抑制作用Fig.4 Inhibitory effect of gallic acid on the activity of porcine pancreatic α-amylase

由圖4可知，不同質(zhì)量濃度的沒食子酸對α-淀粉酶活性均有一定的抑制作用，且隨著質(zhì)量濃度的增加，抑制能力逐漸增強。在實驗設(shè)定的初始質(zhì)量濃度時，沒食子酸的抑制率最低，僅為28.27%。在質(zhì)量濃度為1～9 mg/mL區(qū)間時，沒食子酸對α-淀粉酶活性的抑制呈劑量依賴關(guān)系，抑制率隨著劑量的加大而增大。在此之后，隨樣品質(zhì)量濃度的加大，抑制率無明顯增長。當沒食子酸單體質(zhì)量濃度達到15 mg/mL時，抑制率達到95.52%。通過測定沒食子酸對α-淀粉酶的半抑制濃度I C50，并與陽性對照藥物拜糖平對α-淀粉酶的IC50進行比較，IC50越小，表明抑制效果越小。經(jīng)計算得到，沒食子酸對α-淀粉酶的IC50為3.01 mg/mL，拜糖平對α-淀粉酶的IC50為0.236 mg/mL。

2.2沒食子酸對豬胰蛋白酶酶活性的抑制作用

2.2.1酶質(zhì)量濃度篩選

圖5　豬胰蛋白酶質(zhì)量濃度對酶活性的影響Fig.5 Effect on trypsin concentration on its activity

由圖5所示，隨著酶質(zhì)量濃度的增加，吸光度增大。當酶質(zhì)量濃度達到0.63 mg/mL時，吸光度已趨于飽和，說明酶在這一范圍內(nèi)基本反應完全。因此，酶質(zhì)量濃度選擇在0.63 mg/mL能夠保證酶的充分反應。

圖6　最佳反應時間的選擇Fig.6 Selection of optimal reaction time

2.2.2反應時間的篩選酪氨酸生成量隨反應時間變化的關(guān)系如圖6所示，當反應時間在0～30 min時，隨著時間的增加，酶與底物在不斷地反應生成產(chǎn)物。30 min之后，隨著時間的延長，吸光度變化很小，說明產(chǎn)物生成速率減慢，酶與底物的反應已較為完全。因此，體系最適反應時間選擇30最為合適。

2.2.3酶、底物、抑制劑（沒食子酸）添加順序篩選

圖7　反應體系中添加順序?qū)σ种谱饔玫挠绊慒ig.7 Effect of addition sequence of reactants on trypsin inhibition

由圖7可知，沒食子酸的A、B、C 3種加入順序的抑制率分別為95.91%、94.08%、94.35%。結(jié)果表明，3 種添加順序的抑制率差異不顯著（P＞0.05）。對于沒食子酸來說，A、B、C 3種添加順序的抑制率十分接近，其中順序A的抑制率稍高，順序C僅比順序B高出0.27%，說明添加順序的不同對沒食子酸單體抑制作用的影響很小。為了研究沒食子酸對胰蛋白酶的抑制作用，避免底物的干擾，結(jié)合α-淀粉酶添加順序的實驗結(jié)果，選取順序C為添加順序。

2.2.4最優(yōu)條件下沒食子酸對豬胰蛋白酶活性的抑制作用

由圖8可知，不同質(zhì)量濃度的沒食子酸對胰蛋白酶活性均呈現(xiàn)很強的抑制作用。在質(zhì)量濃度僅為0.4 mg/mL時，抑制率就達到94.56%，當質(zhì)量濃度上升到3.2 mg/mL時，其抑制率為99.24%，已無明顯增長。經(jīng)SPSS軟件分析得到，沒食子酸對胰蛋白酶的IC50為0.019 mg/mL。

圖8　不同質(zhì)量濃度沒食子酸對豬胰蛋白酶活性的抑制作用Fig.8 Inhibitory effect of gallic acid at various concentrations on the activity of porcine pancreatic trypsin

3　結(jié) 論

研究表明，沒食子酸對胰α-淀粉酶和胰蛋白酶均有良好的抑制效果，與之前文獻報道的沒食子酸對α-淀粉酶活性影響效果相符［11］。當沒食子酸質(zhì)量濃度達到15 mg/mL時，對α-淀粉酶活性最大抑制率為95.52%；當其質(zhì)量濃度為3.2 mg/mL時，對胰蛋白酶活性最大抑制率達到99.24%。本結(jié)果對沒食子酸抑制兩種胰酶的作用進行了初步研究，為后續(xù)揭示其抑制作用機理及沒食子酸調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝功能產(chǎn)品的開發(fā)利用提供了參考。

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Inhibitory Effect of Gallic Acid on Pancreatic α-Amylase and Trypsin

QIN Yu， SHAO Yuanyuan， XIONG Shuo， TENG Jie， FENG Jinyu， XIAO Wenjun*
（National Research Center of Engineering Technology for Utilization of Botanical Functional Ingredients，Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China）

The inhibitory effect of gallic acid on the activities of pancreatic α-amylase and trypsin was studied by varying enzyme concentration， the sequence of adding substrate， enzyme and gallic acid in reaction systems， reaction time and gallic acid concentration. Results showed that the maximum inhibition rate （95.52%） of pancreatic α-amylase was achieved by pre warming the enzyme at a c oncentration of 0. 64 mg/mL in the presence of gallic acid at 37 ℃ for 5 min before addition of 1 g/100 mL starch and allowing the reaction to proceed for 15 min. Gallic acid exhibited the strongest inhibition on pancreatic trypsin （by 99.24%） by prewarming their mixture at 40 ℃ for 5 min followed by addition of 1 g/100 mL casein as the substrate and permitting the reaction to take place for 30 min. The inhibitory effect of gallic acid on both en zyme activities was positively associated with its concentration.

gallic acid； pancreatic α-amylase； pancreatic trypsin； inhibitory effect

TS201.2

A

1002-6630（2015）03-0041-05

10.7506/spkx1002-6630-201503008

2014-02-22

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2011BAD10B00；2012BAD33B11）

秦昱（1991—），女，碩士研究生，研究方向為茶及植物功能成分化學。E-mail：qinyu199175@163.com

肖文軍（1969—），男，教授，博士，研究方向為植物功能成分利用。E-mail：xiaowenjun88@sina.com